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羊膜移植在眼表重建中的应用
近10年来眼科界对角膜和结膜上皮细胞的生理及病理的研究有了巨大的进步，认识了正常表型的角膜上皮及结膜上皮是来源于各自的干细胞。角膜的干细胞位于角膜缘，是正常表型角膜上皮化的细胞来源。结膜的干细胞可能位于穹窿部结膜或睑缘皮肤粘膜交界处。 对于由各种原因所致的结膜、角膜眼表缺失，用什么生物材料去修复重建，眼科界一直在研究探索。1981年Akle等在《柳叶刀》（The Lancet）杂志上发表论文，指出单纯的人胎盘羊膜抗原性极低。1995年Kim和Tseng报道用经过处理和保存的羊膜移植重建眼表获得成功。目前羊膜已成为重建眼表的理想生物学材料，至今国外已有许多有关羊膜移植重建眼表的研究报道。国内正在开展该方面的研究。1 眼表的解剖及生理 1980年Nelson首先提出了眼表这一新概念。解剖学上，眼表由上下睑缘皮肤为界的整个粘膜上皮衬里组成。组织学上包括角膜和结膜组织。Tseng等研究指出，维持眼表的健康必须要有下列5个因素的保证：①正常表型的结膜上皮和角膜上皮；②结膜和角膜干细胞的解剖结构及生理功能正常；③正常且稳定的泪膜；④眼睑的解剖生理及功能正常；⑤相关的神经支配及反射功能正常。如传入感觉支（三叉神经第一支），传出运动支（面神经的副交感支和运动支）等必须正常。眼表的首要功能是在睁眼的状态下提供清楚的视力，因此，眼球表面必须覆以一层稳定的泪膜。近年来眼科界已认识到所谓眼表状态的正常，不仅是指角膜、结膜上皮细胞的表型正常及其干细胞系统正常，而且泪腺及其相关的上皮细胞（如杯状细胞），眼睑及眼表相关组织的神经支配及功能必须正常，故此眼表的概念应该是一个整体的系统的概念。
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细胞移植在眼科临床的应用
细胞移植是组织修复的一种重要手段.目前己在眼科临床应用的有视网膜色素上皮细胞移植、虹膜色素上皮细胞移植、角膜缘干细胞移植、结膜上皮细胞移植和视网膜感光细胞移植等.本文复习了各种眼科细胞移植的现况及展望.对一些细胞移植的适应证、远期效果及潜在副作用均有待进一步研究.细胞移植与干细胞工程、基因工程及组织工程结合具有一定的发展前景.
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小梁切除术后功能性滤过泡的维护及重建
迄今为止,外引流术仍然是抗青光眼手术的主要术式.小梁切除术是其中的经典术式.它的主要作用包括解除瞳孔阻滞和外引流两个功能.因此它即可以使功能性关闭的房角重新开放,还可以将房水引流至眼外,房水经巩膜瓣、球结膜上皮细胞、球结膜下淋巴管或毛细血管等多途径吸收.
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γ-干扰素对培养人结膜上皮细胞及泪腺上皮细胞的影响
γ-干扰素(interferon-γ,IFN-γ)是致炎作用很强的细胞因子,在机体各类炎性反应过程中起着重要的作用,它不仅可以诱导多种上皮细胞过量表达细胞间黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1,CD54)、主要组织相容性抗原(HLA-DR)等,而且可诱导细胞凋亡[1].
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不同人工泪液对体外培养的人角结膜上皮细胞的毒性作用比较
干眼是泪液分泌量不足、泪膜稳定性受损所致的眼部疾病[1-2].流行病学研究表明,在世界范围内,干眼发病率很高,与老龄、妇女围绝经期、配戴隐形眼镜及自身免疫性疾病等有关[3-5],其中亚洲人群中发病率约为17％ ～ 33％ [6-9],而白种人发病率相对较低,约为7％～14.6％[3,10].目前,干眼常用的治疗方法是眼表滴用人工泪液,由于干眼是慢性疾患,大部分患者需长期用药,因此其长期疗效和安全性值得关注.本研究比较了不同成分的人工泪液对体外培养的人角膜和结膜上皮细胞的毒性作用,以期为临床用药提供试验依据.
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艾滋病病人眼底荧光血管造影的防护
人类免疫缺陷病毒(HIV)感染主要是通过性传播或血液、体液暴露及母婴垂直传播,HIV病毒在眼部已发现存在于泪液、结膜上皮细胞、角膜上皮细胞中[1].
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养阴润目丸对干眼模型大鼠结膜上皮细胞中IL-1、TNF-α、NF-κB表达的影响
目的:研究养阴润目丸对干眼模型大鼠结膜上皮细胞中白介素-1(IL-1)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、核转录因子-Kappa B(NF-κB)表达的影响.方法:将SD雄性大鼠60只随机分为5组,每组12只,分别为正常组、假手术组、养阴润目丸组、新泪然组、模型组.养阴润目丸组、新泪然组及模型组3组均采用去势法制造干眼模型.治疗3个月后,取大鼠结膜上皮细胞,采用免疫组化法检测IL-1、TNF-α、NF-κB的表达.结果:养阴润目丸组和新泪然组结膜上皮细胞中IL-1、TNF-α、NF-κB的表达明显少于模型组(均P＜0.05).结论:养阴润目丸能有效治疗干眼的作用机制可能与下调结膜上皮细胞中IL-1、TNF-α、NF-κB的表达有关.
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2型糖尿病患者结膜上皮细胞凋亡及炎症状态分析
目的 了解2型糖尿病患者结膜上皮细胞凋亡和炎症状态及其与2型糖尿病患者易患干眼的关系.方法 随机选择2型DM患者35例(35只眼)为实验组、正常人25名(25只眼)为对照组.所有受试者均接受基础泪液分泌试验(SIt)、泪膜破裂时间(BUT)及角膜荧光染色(FL)检查,采用印迹细胞法获得结膜上皮细胞,Annexin v-FITC/PI流式细胞技术(FCM)定量检测细胞凋亡;并用免疫印迹细胞化学染色法检测结膜上皮细胞转化生长因子-β1(TGF-β1)及核转录因子-κB(NF-κB)的表达.结果 2型DM组BUT、SIt值较对照组明显减少(P<0.01);2型DM组FL较对照组明显增强(P<0.01);2型DM组结膜上皮细胞凋亡指数较对照组明显增强(P<0.01);TGF-β1和NF-κB表达较对照组明显增强(P<0.05);2型DM组结膜上皮细胞凋亡指数与TGF-β1和NF-κB的表达呈正相关(P<0.01);2型DM组BUT、SIt值与结膜上皮细胞凋亡指数及TGF-β1和NF-κB的表达呈负相关(P<0.01);2型DM组FL与结膜上皮细胞凋亡指数及TGF-β1和NF-κB的表达呈正相关(P<0.01). 结论2型DM患者结膜上皮细胞凋亡和炎症明显增强,这可能是2型DM患者易患干眼的重要原因之一.
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苯扎氯铵对人结膜上皮细胞毒性的研究
目的 探讨苯扎氯铵(BAC)对无血清培养法培养的人结膜上皮细胞的细胞毒性.方法 采用无血清培养的3-5代人结膜上皮细胞,将不同浓度的BAC(O.01%,0.005%,0.001%,0.0005%,0.0001%)单次作用于结膜上皮细胞15min,分别于处理细胞后6,12,24,48hMTT法检测细胞活力,于处理细胞后48h固定,扫描电镜观察拍照.结果 自BAC处理后6h起,与对照组相比,各浓度BAC均使细胞活力下降(P＜0.01).经过48小时的恢复期,细胞活力未见恢复.随BAC浓度增高,细胞表面微绒毛消失,细胞出现不同程度收缩至脱落至大部分溶解坏死.结论 BAC对于培养的人结膜上皮细胞具有细胞毒性,其毒性作用呈剂量依赖性.
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结膜上皮细胞在角膜基质中转化为角膜上皮样细胞的研究
结膜和角膜上皮细胞来源于不同的细胞系，正常情况下，分化成熟的结膜和角膜上皮细胞表达不同的角蛋白，即角膜上皮细胞表达CK3／CK12蛋白，而结膜上皮细胞表达CK4／CK13蛋白。而且， Ck12和Ck13分别代表终末分化的角膜和结膜上皮细胞，角膜缘干细胞或早期发育角膜细胞不表达CK4和CK13蛋白［1］。
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腺相关病毒介导增强型绿色荧光蛋白基因体外转染兔结膜上皮细胞
目的:研究2型重组腺相关病毒( recombinant adeno-associated virus 2,rAAV2)载体介导增强型绿色荧光蛋白基因(enhanced green fluorescent protein,EGFP) 对体外培养兔结膜上皮细胞的转染和表达情况,为后续研究提供依据.方法:体外培养兔结膜上皮细胞,rAAV2-EGFP 按感染复数(multiplicity of infection ,MOI)为104、105、106 转染第2代兔结膜上皮细胞,转染后第1、3、5、7日倒置荧光显微镜下观察细胞中EGFP表达情况,计算转染率.MTT方法检测rAAV2-EGFP转染对细胞增殖的影响.结果:随着MOI值增大及转染时间延长,EGFP 表达效率逐渐增高,转染后第7～8日达到高峰并维持.MTT检测各MOI组与对照组差别无统计学意义.结论:rAAV2载体可以介导EGFP 基因高效稳定转染兔结膜上皮细胞,并且对细胞增殖无影响.
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TNF-α和TSLP在干眼症患者结膜上皮细胞和泪液中的表达水平及意义
目的 通过检测干眼症(DES)患者结膜上皮细胞和泪液中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)的表达,初步探讨TNF-α和TSLP在DES发病的机制中的作用.方法 分别选取2012年5月至2014年12月在我院眼科就诊的干眼症患者45例,经眼科体检未见异常且无全身免疫性疾病的健康志愿者45例,分成DES组及健康对照组,采集两组结膜上皮细胞并利用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测TNF-α和TSLP的表达水平;采集两组泪液并利用ELISA法检测泪液中TNF-α、TSLP表达水平.结果 与健康对照组相比,DES组结膜上皮细胞中TNF-α、TSLP表达明显强于健康对照组,差异具有统计学意义(P<0.05);与健康对照组相比,DES组泪液中TNF-α和TSLP表达明显高于健康对照组,差异具有统计学意义(P<0.05).结论 TNF-α和TSLP有可能参与了干眼症的发病过程,具体机制有待进一步探讨.
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养阴润目丸对干眼模型大鼠结膜上皮细胞CXCR3和CCR5表达的影响
目的 研究养阴润目丸对干眼模型大鼠结膜上皮细胞CXC型趋化因子受体3(CXC chemokine receptor 3,CXCR3)、CC型趋化因子受体5(CC chemokine receptor 5,CCR5)表达的影响.方法 采用随机数字表法将60只SD雄性大鼠分为5组,每组12只,分别为正常组、假手术组、养阴润目丸组、新泪然组、模型组,除正常组与假手术组外均采用去势法制造干眼模型.造模成功后用药3个月,分别进行泪液分泌试验及泪膜破裂时间的检测,取大鼠结膜上皮组织,采用免疫组织化学法检测CX-CR3、CCR5的表达.结果 用药3个月后,养阴润目丸组、新泪然组泪液分泌量分别为(9.60±1.04)mm和(9.00±1.37)mm,均明显高于模型组的(6.40±0.84) mm(均为P＜0.01);两组泪膜破裂时间分别为(9.61±0.82)s和(9.12±0.69)s,均明显长于模型组的(6.21±0.72)s(均为P＜0.01).养阴润目丸组、新泪然组结膜上皮细胞中CXCR3的表达分别为11.40±1.75和12.71±2.46,均明显少于模型组的29.39±2.48(均为P＜0.05);两组结膜上皮细胞中的CCR5表达分别为26.33±4.17和28.15±4.52,均明显少于模型组的38.78±6.60(均为P＜0.05).结论 养阴润目丸治疗能增加泪液分泌量,延长泪膜破裂时间,下调结膜上皮细胞中CXCR3、CCR5的表达.提示干眼的发病机制与炎症密切相关,养阴润目丸对干眼有一定的治疗作用.
关键词： 养阴润目丸 干眼模型 结膜上皮细胞 CXC型趋化因子受体 CC型趋化因子受体 -
Dispase Ⅱ消化法原代培养兔结膜上皮细胞及鉴定
目的 研究Dispase Ⅱ消化法原代培养兔结膜上皮细胞,观察其体外生长特性.并采用免疫组织化学染色鉴定培养的上皮细胞.方法 Dispase Ⅱ消化法原代培养兔结膜上皮细胞,观祭不同时期细胞的生长情况、细胞形态,做广谱角蛋白、MUC5AC免疫荧光染色及PAS染色鉴定;并比较不同部位结膜上皮细胞增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)表达阳性情况.结果 DispaseⅡ消化法能够获得大量的较纯净的结膜上皮细胞,细胞生长增殖快,能传代4～5代;绝大多数细胞广谱角蛋白免疫荧光染色阳性,少数细胞MUC5AC表达阳性及PAS染色阳性.睑结膜、穹隆部结膜和球结膜细胞PCNA阳性率分别为:(32.14±1.69)%、(27.67 4±1.20)%、(22.76 4±1.73)%,兔睑结膜上皮细胞PCNA阳性率较穹隆部及球结膜上皮细胞的PCNA阳性率高,各部位PCNA阳性率间比较差异有统计学意义(P＜0.05).结论 DispaseⅡ消化法是进行体外结膜上皮细胞培养的理想方法,兔眼睑结膜处可能存在结膜干细胞.
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防腐剂对兔角结膜上皮细胞毒性及玻璃酸钠保护作用的实验研究
目的 观察玻璃酸钠(sodium hyaluronate,SH)对3种眼科常用防腐剂致兔角膜和结膜上皮细胞毒性的保护作用.方法 体外常规方法培养兔角膜和结膜上皮细胞,将不同浓度防腐剂羟苯乙酯(0.3 g·L-1、0.6 g·L-1和1.2 g·L-1)、山梨酸(1 g·L-1和2 g·L-1)以及苯扎溴铵(0.025 g·L-1、0.05 g·L-1和0.1 g·L-1)分别单独和联合4 g·L-1 SH与培养细胞作用,并于作用后1 h、3 h、5 h,利用LIVE/DEAD细胞活性/毒性检测方法,观察细胞酯酶及细胞膜透通性变化,计算细胞存活率.结果 3种防腐剂与细胞作用不同时间后,角膜和结膜上皮细胞存活率均低于对照组,并且与浓度和作用时间呈依赖关系(P＜0.05).其中0.1 g·L-1苯扎溴铵对细胞存活率影响大,作用1 h后,角膜和结膜上皮细胞存活率均为0;0.3 g·L-1羟苯乙酯影响小,作用5 h后角膜和结膜上皮细胞存活率分别为(80.89±7.81)%和(55.00±7.81)%;二者相比差异均有统计学意义(P＜0.05).各时间点结膜上皮细胞的存活率均低于角膜上皮细胞(P＜0.05).在各时间点羟苯乙酯-SH组及山梨酸-SH组,角膜和结膜上皮细胞存活率均高于同浓度防腐剂组(P＜0.05).作用3 h后,0.05 g·L-1浓度苯扎溴铵-SH组与同浓度防腐剂组相比,细胞存活率明显增高(P＜0.05),其余浓度的苯扎溴铵-SH组与同浓度防腐剂组相比,细胞存活率差异无统计学意义(P＞0.05).结论 3种防腐剂中苯扎溴铵对角结膜的毒性大,羟苯乙酯毒性小.3种防腐剂对结膜上皮细胞的毒性作用大于角膜上皮.SH对羟苯乙酯和山梨酸所致细胞毒性均有较好的保护作用,但其保护作用随防腐剂作用时间的增加而减弱.
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几丁聚糖对兔结膜上皮细胞和结膜成纤维细胞增殖的影响
目的研究几丁聚糖对兔结膜上皮细胞和结膜成纤维细胞增殖的影响.方法采用消化法培养结膜上皮细胞,组织块法培养结膜成纤维细胞.通过MTT比色法和细胞计数法测定几丁聚糖对两种细胞增殖的影响.结果几丁聚糖在浓度＞0.03%时能促进结膜上皮细胞的增殖,浓度为0.12%时促进作用明显.结膜成纤维细胞在几丁聚糖浓度＞0.03%时其增殖即受到抑制,抑制作用呈浓度依赖性.结论几丁聚糖有望用于预防睑球粘连.
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HLA-DR抗原在干眼患者结膜上皮细胞中的表达
目的 检测HLA DR抗原及共刺激分子CD80/CD86在不同程度干眼患者球结膜上皮细胞中的表达.方法 -通过结膜印迹细胞法获取球结膜上皮细胞,通过流式细胞仪定量分析HLA DR和共刺激分子CD80/CD86的表达.结果 轻度及重度干眼患者中HLA DR的表达较正常对照组均有明显上调;重度组中Sjgren综合征(SS)组均较非SS组表达增加.重度组干眼患者共刺激分子CD80/CD86的表达较正常对照组差异无统计学意义.结论 HLA DR在不同程度干眼患者结膜上皮细胞中的表达情况反映了疾病的进展.结膜上皮细胞可能作为非专职抗原递呈细胞引起T细胞激活.
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养阴润目丸对干眼模型大鼠结膜上皮细胞中ICAM-1、p38MAPK、p-p38MAPK表达的影响
目的：研究养阴润目丸对干眼模型大鼠结膜上皮细胞中细胞间粘附分子-1（ICAM-1）、丝裂原活化蛋白激酶p38（p38MAPK）、磷酸化-丝裂原活化蛋白激酶p38（p-p38MAPK）表达的影响。方法将60只SD雄性大鼠随机分为5组（正常组、假手术组、养阴润目丸组、新泪然组、模型组），每组12只。除正常组与假手术组外均采用去势法制造干眼模型。造模成功后一周开始分别给药治疗。用药3个月后，分别进行泪液分泌试验（SIT）及泪膜破裂时间（BUT）的检测，取大鼠结膜上皮细胞，采用免疫组化法检测p38MAPK的表达，采用Western blot法检测ICAM-1、p-p38MAPK的表达。结果与模型组比较，养阴润目丸组SIT明显增多，BUT明显延长；养阴润目丸可显著减少结膜上皮细胞中ICAM-1、p38MAPK、p-p38MAPK的表达，差异有统计学意义（P<0.01）。结论养阴润目丸可有效改善眼表症状，增加泪液分泌量，延长泪膜破裂时间，下调结膜上皮细胞中ICAM-1、p38MAPK、p-p38MAPK的表达。提示干眼的发病机制与炎症及p38MAPK信号通路相关，养阴润目丸对干眼的治疗具有一定的应用前景。
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人羊膜上皮细胞分化为结膜上皮细胞实验研究
目的 探讨人羊膜上皮细胞在特定环境下诱导分化为结膜上皮细胞的可能性.方法 人羊膜上皮细胞与去上皮结膜基质的结膜匀浆培养液孵育,角蛋白CK4、CK13、MUC5AC免疫组化鉴定细胞表型;过碘酸-Sehiff试剂(PAS);酶联免疫吸附(ELISA)法检测不同时间培养液内MUCSAC水平;逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测分化细胞MUCSAC基因表达.结果 人羊膜上皮细胞经诱导培养后,免疫组化显示角蛋白CK4、CK13、MUC5AC表达阳性;PAS染色阳性;ELISA检测1～7 d内培养溶剂化物中均有微量MUC5AC且逐渐升高;RT-PCR检测分化细胞MUC5AC表达阳性.结论 人羊膜上皮细胞具有干细胞分化潜能,在特定条件下可定向分化为具有一定生理功能的结膜上皮细胞.
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人结膜上皮细胞在不同浓度甘油羊膜表面负载培养的研究
目的比较人结膜上皮细胞接种培养在不同浓度的甘油保存液、不同保存温度及不同保存时间羊膜上的差异.方法将传代培养的第2代结膜上皮细胞分别接种在纯甘油及50%甘油(DMEM或平衡盐液:甘油=1:1)保存的羊膜表丽,观察其体外培养情况.结果纯甘油保存的羊膜组结膜上皮细胞48h后即贴壁,且生长旺盛,而50%甘油短期保存羊膜组结膜上皮细胞不能贴壁生长.结论经纯甘油保存的羊膜接种结膜上皮细胞易贴壁生长,而采用50%甘油短期保存,则因羊膜上皮尚未脱落,而导致接种的结膜上皮细胞不易贴壁生长.
