糖尿病眼表改变的发病机制研究现状

糖尿病是由胰岛素分泌或者作用缺陷引起的以高血糖为主要特征的代谢性疾病，在眼部可引起多种病变。其中眼表改变主要有角膜改变和泪膜改变，糖尿病患者角膜上皮和内皮细胞的屏障功能会受到明显影响，糖尿病会导致泪膜质和量的改变。

细胞凋亡与角膜移植排斥和免疫耐受诱导的研究进展

角膜移植是治疗角膜疾病的主要方法和手段,移植后的免疫排斥反应是导致角膜移植术失败的主要原因.细胞凋亡是一种不同于细胞坏死的由基因控制的细胞自主性程序性死亡方式,与组织器官的发育、分化和正常生理活动的维持以及某些疾病病理过程的发生等有着密切的联系.角膜移植后同时存在浸润炎性细胞和角膜细胞的凋亡,浸润炎性细胞的凋亡导致免疫耐受,而角膜细胞的凋亡既可导致移植排斥,又可以诱导免疫耐受.

角膜疾病应用基础研究的现状和策略

我国在角膜应用基础研究的层次和规模方面尚与国际先进水平存在差距,缺少意义重大、思路创新、促进学科发展的研究.除外部因素,眼科研究人员本身亦应对本专业的现状、进展、发展趋势等有基本了解,才能促进新理论、新观点、新技术的产生.本文围绕角膜上皮干细胞、基质内抗原提呈细胞、角膜内皮细胞三种重要细胞以及角膜感染、营养不良和移植失功三种重要病理过程,结合国内外的研究现状,分析我国角膜病基础研究领域可拓展的方向和策略.

酸豆多糖可使角膜细胞免受紫外线损害

酮咯酸氨丁三醇对兔角膜细胞及纤连蛋白的影响

目的 探讨酮咯酸氨丁三醇(Ketorolac tromethamine 0.5%,Acular,安贺拉)对培养兔角膜细胞及细胞外基质纤连蛋白(Fibronectin,FN)的影响.方法 选用原代及传代兔角膜细胞,实验组加入含不同浓度酮咯酸氨丁三醇的培养液,对照组加入等量空白培养液,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测其对细胞增殖的抑制,倒置相差显微镜观察其对细胞的形态学改变,并进一步采用免疫细胞化学和ELISA研究其对角膜细胞分泌FN的影响.结果 酮咯酸氨丁三醇浓度为50-175μg/ml时,作用24、48、72 h均抑制角膜细胞的增殖(P均＜0.05),并呈剂量依赖性.免疫细胞化学显示对照组可见胞浆着色及胞间丝状着色,而加药组仅见胞浆少量着色.ELISA结果显示低浓度时FN含量增加,而高浓度时其含量明显减少.结论 酮咯酸氨丁三醇对角膜细胞的增殖有抑制效应,呈剂量依赖性,并且高浓度时可明显减少FN的含量.酮咯酸氨丁三醇可能通过抑制角膜细胞的增殖和减少细胞外基质,从而防止屈光术后的屈光回退.

准分子激光原位角膜磨镶术后角膜细胞凋亡的研究

目的 了解准分子激光原位角膜磨镶术(laser in situ keratomileusis,LASIK)后早期角膜基质细胞凋亡的特点并探索LASIK术后角膜愈合反应程度与角膜刀的机械损伤、激光能量的相关性.方法 20只新西兰白兔,其中10只兔左眼为LASIK-4.0D组、右眼为LASIK-8.0D组、另10只兔左眼为单纯角膜瓣组、右眼作为空白对照组,在术后4小时处死兔取角膜制作病理切片,行透射电镜检查,用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标法(terminal-deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP nick end labeling,TUNEL)原位显示凋亡细胞,激光扫描共聚焦显微镜观察凋亡细胞形态,定量统计比较凋亡水平差别.结果 三个手术组中角膜基质中均出现凋亡细胞,主要分布于角膜瓣和基质床交接面两侧50μm范围内的基质层中;瓣缘的凋亡水平高于中央部.而空白对照组中,凋亡细胞仅出现在表层上皮,角膜基质细胞未见凋亡.三个手术组的TUNEL阳性细胞计数进行方差分析,三组之间差异无显著意义(F=1.008,P＞0.05);每组不同个体的TUNEL阳性细胞计数存在明显的差异.结论 正常角膜基质细胞不发生凋亡.角膜基质细胞凋亡与角膜损伤有关.LASIK术后早期即可出现角膜基质细胞的凋亡表达,该表达与角膜瓣的制作有关,与激光切削的深度、能量无明显的相关性.

准分子激光角膜切削术与磨镶术后兔角膜基质细胞凋亡的研究

目的 研究准分子激光角膜切削术(photorefractive keratectomy,PRK)和准分子激光原位角膜磨镶术(laser in situ keratomileusis,LASIK)后不同时间点角膜基质细胞凋亡的特点并探索不同手术方式、不同的矫正度数对角膜基质细胞凋亡水平的影响.方法 50只新西兰纯种白兔随机分为A、B两大组,每组25只;A组兔子为PRK组,B组兔子为LASIK组;每组兔子左眼进行-4.0D激光切削,右眼进行-8.0D激光切削.分别在术后4 h、24 h、1 w、4 w和3 m五个时间点处死兔子,每个时间点每组随即处死5只兔子,取兔角膜制作病理切片,行透射电镜检查,用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(terminal-deoxynucleotidyl transferase mediated Dutp nick end labeling,TUNEL)原位显示凋亡细胞,激光扫描共聚焦显微镜观察凋亡细胞形态,定量统计比较凋亡水平的差别.结果 在术后4 h、24 h PRK组角膜基质中凋亡细胞较多,其中PRK-8.0D组的凋亡细胞数较PRK-4.0D组多,其差异有显著性意义(P＜0.05);在术后4 h、24 h两个时间点,PRK-8.0D组与LASIK-8.0D组的角膜基质中的凋亡细胞数进行比较,两者差异有显著性意义(P＜0.05);在不同的时间点,LASIK-4.0D组与LASIK-8.0D组TUNEL阳性细胞计数的比较,两者之间差异无显著性意义(P＞0.05).结论 LASIK术后角膜基质细胞的凋亡水平较PRK低,凋亡程度与制瓣中的角膜损伤有关,与切削深度无明显相关;PRK术后角膜基质细胞的凋亡水平随切削深度增加而增高.

结膜上皮细胞在角膜基质中转化为角膜上皮样细胞的研究

结膜和角膜上皮细胞来源于不同的细胞系，正常情况下，分化成熟的结膜和角膜上皮细胞表达不同的角蛋白，即角膜上皮细胞表达CK3／CK12蛋白，而结膜上皮细胞表达CK4／CK13蛋白。而且， Ck12和Ck13分别代表终末分化的角膜和结膜上皮细胞，角膜缘干细胞或早期发育角膜细胞不表达CK4和CK13蛋白［1］。

前房内注射不同剂量的血凝酶对兔眼角膜的作用

眼科前房出血比较多,包括外伤导致的和术中导致的出血等.外伤出血通常全身用药,根据个体差异,作用效果的时间长短不确定.而且在眼科的手术中,视野小,即使是少量的渗血也会影响手术视野,妨碍手术顺利进行.特别是在内眼手术中的出血,如果处理不当可造成严重的并发症.现在,应用于局部和全身的止血药物有好几种,选择一种速效、安全的止血药是增加手术安全性和可靠性的重要因素[1],同时也可以增加另一种直接局部用药的途径去治疗外伤造成的出血.

固有免疫在脂多糖、烟曲霉菌诱导的角膜细胞耐受中的作用

研究烟曲霉菌(AF)、脂多糖(LPS)能否引起角膜细胞的耐受反应,增强角膜对病原体刺激的防御功能.小剂量AF、LPS分别预处理永生化人角膜上皮细胞(THCE)和永生化人角膜基质细胞(THSF),20 h后给予大剂量AF或LPS再次刺激.于再次刺激后4 h收集细胞上清,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞因子IL-8的分泌,趋化实验检测LPS预处理引起THSF对PMN趋化的改变.于再次刺激后1 h收集细胞,实时RT-PCR检测细胞因子IL-8 mRNA和抗菌肽CCL20和LL-37 mRNA的表达.结果显示AF、LPS分别预处理THCE和THSF均可显著抑制IL-8的分泌.LPS预处理THSF抑制IL-8 mRNA的表达,增加CCL20和LL-37 tuRNA的表达,并且抑制中性粒细胞(PMN)向角膜细胞的趋化.因此角膜细胞的耐受反应可避免过度的炎症反应,减轻角膜感染,在角膜炎症中起保护性作用.

传代培养角膜细胞的染色体遗传变异率分析

目的 分析传代培养角膜细胞染色体数目的变异率.方法 选择人角膜上皮细胞(HCE)、牛角膜内皮细胞(BCE)和兔角膜上皮细胞(RCE)细胞,采用直接法制备传代细胞染色体标本,常规Giemsa染色,1 000倍光学显微镜下计数分裂相染色体数目,进行核型分析,统计染色体数目变异情况.结果 HCE染色体众数为56 ～ 65,为超二倍体;BCE染色体众数为27 ～ 34,为亚二倍体;RCE染色体众数为74 ～ 88,为超二倍体.与起源细胞相比,以上3种传代细胞染色体数目均发生了改变.结论 该项核型分析为HCE、BCE和RCE 的功能研究提供了重要的参考信息.

兔角膜缘上皮细胞体外培养及其生物学特性的初步研究

目的:建立体外培养兔角膜缘上皮细胞的方法,观察其体外生长的生物学特性.方法:应用组织培养的方法,对兔角膜缘上皮细胞进行体外原代和传代培养.用倒置显微镜观察培养的兔角膜缘上皮细胞体外生长的特征.用苏木精-伊红染色、糖原(PAS)染色、细胞角蛋白免疫组化染色和电镜检查的方法对培养细胞进行形态学检查和鉴定.结果:兔角膜缘上皮细胞可以在体外成功的培养传代.原代培养细胞大多48 h贴壁,5天后旺盛生长,15天形成单层.传代培养细胞次日贴壁10天形成单层.细胞角蛋白AE1单克隆抗体染色阳性,PAS染色阴性.培养细胞呈多角形,细胞表面具有丰富的微绒毛,细胞之间有桥粒连接.结论:应用组织培养的方法可以成功获得原代和传代培养的兔角膜缘上皮细胞,培养的细胞具有与正常兔角膜上皮细胞相一致的生物学特性.

准分子激光原位角膜磨镶术后角膜基质细胞凋亡的实验研究

目的 了解准分子激光原位角膜磨镶术(1aser in situ keratomileusis,LASIK)后早期角膜基质细胞凋亡的特点并探讨LASIK术后角膜基质细胞凋亡水平与角膜刀的机械损伤、激光切削的相关性.方法 20只新西兰白兔40只眼随机分为4组,每组10只眼,A组行单纯角膜瓣制作术,B组按-4.0D行LASIK术,C组按-8.0D行LASIK术,D组为空白对照.在术后4小时处死兔子取兔角膜制作病理切片,行透射电镜检查,用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标法(teminal-deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP nick endlabeling,TUNEL)原位显示凋亡细胞,激光扫描共聚焦显微镜观察凋亡细胞形态,定量统计比较凋亡水平差别.结果 空白组角膜基质未出现凋亡细胞表达,其余3个手术组中角膜基质中均出现凋亡细胞,主要分布于角膜瓣与基质床交接面两侧50μm的角膜基质中;瓣缘的凋亡水平高于中央部.3个手术组的TUNEL阳性细胞计数进行方差分析,3组之间差异无显著意义(F=1.008,P＞0.05).结论 LASIK术后早期即可出现角膜基质细胞的凋亡表达,该表达与角膜瓣的制作有关,与激光切削的深度无明显的相关性.

角膜激光共焦显微镜在糖尿病视网膜病变中的应用

目的 探讨角膜激光共焦显微镜在观察糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy,DR)患者角膜上皮下神经丛、角膜细胞密度及形态变化中的价值.方法 选取确诊的DR患者94例(114眼),其中非增生型糖尿病视网膜病变(non-proliferative diabetic retinopathy,NPDR)患者41例(52眼,NPDR组)、增生型糖尿病视网膜病变(proliferative diabetic retinopathy,PDR)患者53例(62眼,PDR组),收治时间2016年1月至2017年4月,同期糖尿病无眼底改变的患者40例(40眼)作为对照组,三组均采用角膜激光共焦显微镜进行检测,对比各组角膜上皮下神经丛、角膜细胞密度及形态的变化.结果 NPDR组和PDR组患者的角膜基底层、浅基质层、中基质层、深基质层的细胞密度均显著低于对照组(均为P＜0.05);PDR组患者的角膜基底层、浅基质层、中基质层、深基质层的细胞密度均显著低于NPDR组(均为P＜0.05);NPDR组和PDR组患者的角膜内皮细胞密度、六边形细胞比例、神经纤维密度、神经纤维长度均显著低于对照组(均为P＜0.05),NPDR组和PDR组患者的内皮细胞变异率、神经分支密度均显著高于对照组(均为P＜0.05);PDR组患者的角膜内皮细胞密度、六边形细胞比例、神经纤维密度、神经纤维长度分别为(1962.0±117.3)个·mm-2、46.1％±5.5％、(15.4±3.3)根·mm-2、(6.2±2.7) mm·mm-2,均显著低于NPDR组的(2381.4±144.0)个·mm-2、58.2％±7.0％、(20.6±3.8)根·mm-2、(8.6±2.4)mm·mm-2(均为P＜0.05),PDR组患者的内皮细胞变异率、神经分支密度均显著高于NPDR组(均为P＜0.05).结论 角膜激光共焦显微镜能有效观察DR患者角膜上皮下神经丛、角膜细胞密度及形态变化,为临床诊断、治疗提供指导.

慢病毒载体介导TLR2基因干扰大鼠角膜上皮细胞和基质细胞的实验研究

目的 观察慢病毒载体(lentiviral vector,LV)介导TLR2基因干扰大鼠角膜上皮细胞(corneal epithelial cell,CEC)和基质细胞(corneal stromal cell,CSC)的有效性和安全性.方法 分别培养大鼠CEC和CSC,转染组用携带绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,eGFP)和TLR2小干扰RNA (small interference RNA,siRNA)的LV转染,空白对照组加入空白培养液,阴性对照组加入不携带目的基因的LV.转染组按佳感染复数(multiplicity of infection,MOI)分别为10、50、100、200加入LV-TLR2-siRNA-eGFP,选择eGFP表达强的MOI进行后续实验,观察细胞形态,CCK8检测细胞增殖情况.流式细胞仪检测两种角膜细胞的转染效率,RT-PCR检测转染后TLR2 mRNA的表达情况.结果 MOI=200时转染CEC和CSC荧光表达高,和空白对照组相比细胞形态未发生明显改变;CCK8结果显示转染组与空白对照组、阴性对照组的IOD值差异均无统计学意义(均为P＞0.05);流式细胞仪检测CEC和CSC转染效率分别为77.600％±1.100％和76.300％±1.387％,和阴性对照组相比差异均有显著统计学意义(均为P＜0.001).RT-PCR检测转染后CEC和CSC TLR2mRNA相对表达量均较对照组明显下降,差异均有显著统计学意义(均为P＜0.001).结论 LV-TLR2-siRNA-eGFP可在体外稳定有效转染CEC和CSC,且对细胞安全性无影响,可有效下调TLR2 mRNA的表达.

改良兔角膜细胞冻存与复苏方法的实验研究

目的 建立一种改良的兔角膜细胞冻存和复苏的方法.方法 兔角膜细胞消化培养.取第2代细胞分别进行传统和改良方法冻存,于冻存后的第2周、3个月、6个月、1 a分别行传统和改良的复苏方法.用MTT法测细胞生长曲线,应用三因素分析统计方法评定不同冻存方法、不同复苏方法、不同复苏时间三因素单独和(或)组合对细胞复苏率的影响.结果 兔角膜细胞体外生长良好.培养细胞Vim单克隆抗体阳性.细胞的复苏率均受不同冻存方法和复苏方法单、双因素影响,不受复苏时间及与冻存和复苏方法单、双因素及三因素的影响.冻存复苏后生长曲线良好.结论 改良后的兔角膜细胞冻存和复苏方法可使细胞保持佳生物学特性,细胞复苏率高,适用于体外实验研究.

急性排斥期大鼠角膜移植物基质细胞凋亡的研究

目的研究急性排斥期角膜移植物基质细胞凋亡发生的规律,分析基质细胞凋亡与急性免疫排斥反应的关系.方法建立大鼠穿透性角膜移植动物模型.实验分组:A组,同种异体角膜移植组,Wistar→SD;B组,同基因角膜移植组,Wistar→Wistar;2移植组受者均为10只.C组,正常对照非移植组,健康Wistar大鼠10只.急性排斥期取材,应用细胞凋亡原位末端标记(TUNEL法)检测角膜基质细胞凋亡情况.对TUNEL染色结果采用全自动图像分析系统处理,计算阳性单位PU值.结果与正常角膜及同基因角膜移植片相比,急性排斥期同种异体角膜植片基质细胞凋亡明显增多.各实验组阳性单位PU平均值分别为:28.68±3.64,10.80±3.20,均明显高于对照组2.72±2.08,差异有显著性(P＜0.01).两实验组相比,PU值差异有显著性(P＜0.01).结论细胞凋亡可能是导致角膜移植排斥反应发生的主要因素之一.

组织工程角膜种子细胞的研究进展

随着细胞培养及组织工程技术的发展,组织工程角膜种子细胞方面的研究获得一定进展,主要是探讨维持角膜种子细胞的活性及正常形态和性质的方法,并通过适当的载体进行移植,研究重建与正常角膜具有相同的形态结构及生理功能的组织工程角膜,并终应用于临床.本文就组织工程角膜种子细胞方面的进展做一综述.

角膜细胞因子网络的研究

信号从上皮层传递到基质层或者从基质层传递到上皮层构成了上皮-基质相互作用的基础.上皮-基质相互作用在胚胎发育[1-3]、形态发生[4-6]、伤口愈合[7,8]及肿瘤转移[9]等方面起到至关重要的作用.

角膜中期保存过程中细胞凋亡的初步研究

目的探讨角膜中期保存过程中细胞凋亡现象,为改进角膜保存方法提供理论依据.方法采用M-K液、M-K+EGF液和Optisol3种保存液保存兔和人角膜,用光镜、电镜及TUNEL标记技术检测细胞凋亡发生情况.结果3种保存液保存3、5 、7天的兔角膜,在上皮、基质及内皮细胞层均可见典型的细胞凋亡发生.保存时间不同, 保存液不同,TUNEL阳性细胞数不同.M-K液和Optisol液保存4天的人角膜同样可见细胞凋亡发生.结论细胞凋亡是角膜中期保存过程中细胞丧失的另外一种可能机制; 细胞凋亡的发生对角膜中期保存效果存在一定的影响;表皮生长因子在角膜中期保存过程中没有阻止角膜细胞凋亡发生的作用.