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生物信息学在毒力岛研究中的应用
1986年Hacker等在泌尿道致病性大肠杆菌(UPEC)536株染色体上发现两个可以发生缺失的大片段,片段丢失后,细菌产生溶血素和P菌毛的能力随之丧失,细菌的毒力受到影响.在此发现的基础上于1994年提出了毒力岛(pathogenicity island)的概念,认为毒力岛是整合于细菌基因组的外源性DNA片段,这些特殊片段存在于致病型菌株上,赋予细菌毒力,却在与之亲缘关系密切的非致病菌株上不存在.
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细菌进化中的基因横向转移
越来越多的证据表明,通过横向基因转移(lateral gene transfer, LGT)而获得外源DNA是细菌中的普遍现象,在很多情况下,有可能是细菌进化的关键因素[1-12].随着基因组序列信息的大量增加和基因芯片等基因组学技术的不断进步,人们已经能够追踪亲缘关系较近的细菌中某些基因的出现、消失与再现,从而探讨细菌基因组进化的一些基本规律.近年来这方面研究在沙门菌(Salmonella)属的细菌中多有报道[6,12-20].沙门菌属的细菌虽然在遗传上互相非常接近,但是在宿主和临床表现上可有很大差异,因此,特别适合于细菌基因组进化的研究.3株沙门菌的全基因组测序工作已经完成,还有一些目前正在测序之中(表1).通过序列比对就有可能找出LGT新获得的基因,并可发现不同的细菌在基因组整体水平上的差异.本文中,我们将简要地介绍沙门菌分类学的变迁及细菌基因组进化研究的新成果,然后以沙门菌为例集中探讨LGT,包括概述检测LGT的方法,后讨论LGT对进化的意义.
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致泻大肠埃希菌及其毒力岛研究进展
在大肠埃希菌中有些菌株能引起小儿和成人腹泻的称为致泻大肠埃希菌(DDEC).根据致泻大肠埃希菌的致病特点,目前公认的至少有6类:肠致病性大肠埃希菌(EPEC);肠出血性大肠埃希菌(EHEC);肠产毒素大肠埃希菌(ETEC);肠集聚性大肠埃希菌(EAggEC);肠侵袭性大肠埃希菌(EIEC);产志贺样毒素大肠埃希菌(SLTEC)等[1].在国内腹泻病原学研究中,还不断有新的致泻大肠埃希菌被发现,如高毒力岛大肠埃希菌(HPIEC)等[2].毒力岛也称致病岛(PAI)是近年来在医学细菌学领域中出现的一个新名词,各种病原菌的毒力因子都有一个原核基因组的特殊编码区,这个区域命名为毒力岛.PAI初是在对人致病性大肠埃希菌中发现的,与细菌的致病性密切相关[3].PAI的产生是通过水平基因转移,从一种病原菌转移到另一种细菌中,细菌的遗传物质亦从这种细菌基因组转移到另一种细菌,并构建新的基因岛(genomic island)或PAI.细菌在短期内发生质与量的飞跃,产生许多新的变种,这种演变是细菌进化的关键.基因岛的功能是直接或间接地增强了细菌的适应性,使细菌和生存宿主之间相互影响,有助于细菌生态学的适应性和致病性,推进了细菌的演变[4].
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O139群霍乱弧菌Ⅰ类整合子结构分析
O139群霍乱弧菌是一种引起严重腹泻的肠道病原菌.随着对常用抗菌药物耐药的霍乱弧菌出现,研究其耐药机制和传播也变得重要.Ⅰ类整合子是细菌获得和传播耐药基因的重要机制,携带位点特异性的重组酶系统,可特异性识别耐药基因盒结构,并将其整合在其中,形成各种组合的多重耐药整合子,转移到细菌基因组其他位点上或通过质粒等在细菌之间扩散.本科在2005年分离的1株O139群霍乱弧菌NB05030中检出发现携带aadA2耐药基因盒的Ⅰ类整合子结构.
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一次腹泻病原菌的随机扩增多态DNA特征
RAPD(随机扩增多态DNA)分析细菌基因组结构的突出优势是无须知道待测细菌的遗传背景,技术成熟简便,从扩增产物可以比较不同属、种、型及株系间的DNA指纹特征.1998年6~10月,呼和浩特地区发生小儿急性肠炎,为进一步认识腹泻的病原菌,对保存菌株进行了RAPD分析.一、材料与方法12株福氏志贺菌2a型、2株福氏志贺菌6型和5株奇异变形杆菌进行细菌基因组DNA的RAPD分析.随机引物选择CyberSyn生物工程公司的CY10系列套式引物,PCR扩增在PE 480型上进行.收集生长对数期菌体,0.9% NS洗涤2次,15 000 r/min离心5 min,用EB平板测定DNA含量,稀释至4 ng/ml.25 μl常规反应体系,40个循环,退火温度根据引物的不同选择从37℃到40℃.1.5%的琼脂糖凝胶电泳,紫外灯下拍照记录.
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探讨克服细菌对抗生素耐药的新靶点
目前,需要更多的抗菌剂及新的治疗方法来应对愈演愈烈的抗生素耐药问题.随着对细菌基因组序列了解的深入,期望发现更多新靶点并研究出更多抗菌剂.可以用定向筛选和随机筛选两种方法来筛选新靶点.选定靶点后要确认靶点确实有效,并确定靶点的功能,开发先导化合物并进行优化,进而开发新药.新药开发面临着许多问题,因此,要不断改进研发过程.
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人类肠道菌群DNA提取影响因素的研究
目的 研究提取人类粪便中细菌基因组DNA的影响因素.方法 采用溶菌酶和十二烷基磺酸钠(SDS)+石英砂+酚-氯仿抽提法提取粪便标本中细菌DNA,用PCR扩增细菌16S rDNA.比较不同粪便量,不同放置时间,不同放置温度下的粪便细菌DNA浓度及纯度改变;用Chao index评测高通量测序的结果.结果 采用20 mg粪便量提取出的细菌DNA的浓度高;常温下放置3h后,提取的细菌DNA的浓度开始下降;在-20℃放置12 h后,细菌DNA的浓度开始下降;-70℃放置48 h后细菌DNA的浓度开始下降;样品纯度均在1.8以上;Chao index曲线趋于平缓表明测序数据量足够大.结论 提取肠道细菌基因组DNA时,粪便标本取样量以20 mg为宜,常温下粪便标本放置不超过2h,本研究所使用的方法所提取的DNA浓度可以达到高通量测序的样本要求.
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临床标本细菌基因组DNA提取方法探讨
目的 优化细菌基因组DNA提取方法,使其适合临床细菌分子生物学检测需要.方法 分别采用专用DNA提取液法、热裂解法、溶菌酶法、热裂解法与碱性裂解法组合改良法,对纯培养细菌和临床标本中细菌基因组DNA进行提取.结果 专用DNA提取液法、溶菌酶法提取成功率为100%,热裂解法革兰阳性菌提取成功率为0%,革兰阴性菌成功率为100%,碱性裂解液法在NaOH浓度大于4 mmol时提取成功,临床标本在NaOH溶液超过20mmol/L并含2%SDS时细菌基因组DNA的提取成功率为100%.结论 热裂解法与碱性裂解法组合改良法提取细菌基因组DNA方便快速、简单实用,适用临床标本检测.
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三类细菌基因组和 CpG ODN 作为禽流感病毒 H5N1 亚型灭活油乳苗佐剂的研究
目的:通过两种免疫策略比较三类细菌基因组和 cpG ODN 对禽流感病毒(AIV) H5N1 灭活油乳苗的影响.方法:苯酚氯仿法抽提革兰氏阴性致病菌(大肠杆菌O2)、阳性致病菌(金黄色葡萄球菌)和阳性益生菌(粪链球菌FQ68)的基因组,并人工合成 cpC ODN 作为 AIV 油乳苗的佐剂,分佐剂与油苗分开和油裹于油苗内两种途径免疫鸡群,检测血凝(HI)抗体效价、HA 抗原特异性 IgG 效价、IL-IO 和 IFN-γ浓度.结果:当佐剂与油苗分开免疫时,各佐剂在所有的时间点上削弱(P>O.05)或者显著地削弱(P
0.05);当佐剂油裹于油苗里时,CpG ODN 和 FQ68 基因组在所有的时间点上提高(P>0.05)或者显著地提高(P -
CpG ODNs临床应用前景
细菌基因组DNA和人工合成的CpG ODNs主要依赖其序列中CpG基序激活特异性和非特异性系统的细胞发生免疫应答.
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16SrDNA序列分析技术在临床细菌鉴定中的应用进展
传统的细菌系统分类的主要依据足形态特征和生化反应,对于有些疑难菌、少见菌的鉴定往往雄以达到理想的鉴定效果二近代分子遗传学和分子生物学实验技术的迅猛发展使微生物学的分子鉴定成为了可能,其中包括G+C mol%含量测定、16SrRNA基因(16SrDNA)和16 ~ 23SrRNA基因序列分析等.原核生物16SrDNA是编码16SrRNA的基因部分,具有种属保守性.本文就16SrDNA序列分析技术在临床细菌鉴定巾的应用进展作一综述.1.16SrDNA的分子结构与特点细菌16SrDNA存在于所有细菌的染色体基因组,其特点为:(1)以多拷贝形式存在于细菌基因组中.(2)由可变区和保守区组成,保守区为所有细菌共有.可变区具有属或种的特异性,可据此进行引物和探针的设计.(3)其为长度适巾的1542bpDNA序列[1].由于16SrDNA与细菌整个基因组相比,有高度的保守性且具有良好的时钟性质,有人将其称为细菌的"化石".同时几乎所有病原菌的16SrDNA测序均已完成,因此16SrDNA被选为细菌鉴定的新目标[2-3].
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美科学家完成人肠道微生物组分析
美国的科学家在6月2日出版的Science(2006,312:1355)上发表了对人肠道微生物组(microbiome)环境基因组学(metagenomics)的分析报告.他们通过对2名健康成年人粪便标本的DNA测序发现,其仅有1%~5%不是来自细菌.他们又将已知的细菌基因组与人类基因组进行比对后发现,下消化道细菌的基因数量达6万多种,要比在人类基因组中发现的多出1倍.研究人员称,人类是一个超生物体(superorganism),即由细菌和人体细胞组成的混合体.该研究结果对许多人类疾病的临床诊断和治疗研究有深远的意义.
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老药新用--氯喹治疗SIRS的作用研究进展
脂多糖/内毒素(Lipopolysaccharide/endotoxin, LPS)、细菌基因组DNA是导致全身性炎症反应综合征SIRS(Systemic inflammatory response syndrome, SIRS)及脓毒症的主要致病因子,它们通过激活单核-吞噬细胞系统大量释放TNF-α、IL-6、IL-12等多种细胞因子引起SIRS的发生.但目前国际上针对LPS、细菌DNA介导的SIRS尚无有效的防治措施,因此寻找有效的治疗措施具有重要意义.
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优化血小板制品中细菌基因组抽提方法
目的:建立裂解液加热煮沸法抽提细菌基因组DNA.方法:选取大肠埃希菌、金葡菌分别应用五种不同方法抽提细菌基因组,Tagman荧光定量PCR检测抽提产物.并在两种细菌中验证chelex-100抽提方法的灵敏度.结果:对相同浓度的大肠埃希菌、金葡菌样品进行抽提时,chelex-100加热煮沸法抽提所得样品在后续荧光定量PCR检测中CT值均为小.应用该方法对两种细菌进行抽提鉴定时,灵敏度可达到每毫升个位菌数.结论:chelex-100裂解液加热煮沸法抽提细菌基因组DNA操作简便、省时、经济,为血液标本细菌基因检测在临床上的大规模应用奠定基础.
关键词: chelex-100裂解液加热煮沸 细菌基因组 血小板 -
自杀基因治疗胃肠道肿瘤的研究进展
随着分子生物学及相关学科的进展,肿瘤的基因疗法倍受关注,其中自杀基因疗法显示了较好的应用前景,该疗法又称药物敏感基因疗法、分子化疗或病毒介导的酶解前药疗法(VDEPT).其原理是将一些病毒或细菌基因组中前药转换酶基因(也叫自杀基因)导入肿瘤细胞,该基因编码特殊的酶,可将原先对哺乳动物细胞无毒性的前药在肿瘤细胞中代谢为毒性产物,从而引起这些细胞自杀,而正常组织可免受化疗损伤.现就近5年来自杀基因治疗胃肠道癌肿的进展综述如下.
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口腔细菌基因组
随着遗传密码的发现,细菌基因组及重组DNA技术取得较大发展.200余种细菌基因组计划已经完成或正在进行,本文描述了几种口腔细菌基因组的特征,强调菌种间的亲缘关系,关注基因组学的比较,因为其对口腔致病菌的基础、临床研究都有广泛影响.