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03 应用实时荧光RT-PCR方法检测流感病毒(甲和乙型)
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荧光定量PCR检测乙肝病毒DNA的临床意义
目的:探讨荧光定量PCR检测乙肝病毒DNA 的临床应用价值.方法:对193份临床血清标本采取ELISA 法进行定性检测,并依据乙肝两对半定性结果进行分组,再用实时荧光PCR定量检测.结果:大三阳模式中HBV-DNA 定量阳性率为95.52%,PCR定量拷贝数为(4.32±1.63)×106/ml;小三阳模式中阳性率为54.79%,拷贝数为(2.45±2.23)×105/ml;HBsAg(+)、HBcAb(+)模式中阳性率为35.71%,拷贝数为(6.74±1.18)×104/ml;HBsAg(-)、HBeAg(-)模式中阳性率为5.13%,拷贝数为(2.14±1.11)×104/ml.结论:PCR定量测定HBV-DNA 可以真实地反映体内乙肝病毒感染和复制及病毒载量情况,且检测快速准确.
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PCR技术在牛羊肉制品成分鉴定及掺假鉴别中的应用
近年来诸如“马肉丑闻”“挂羊头卖狗肉"事件时有发生,食品掺假引发了公众对食品安全的担忧以及各国政府的关注。近年来普通PCR技术、实时荧光PCR法、多重PCR等技术快速发展,在肉制品成分鉴定及掺假鉴别的研究中发挥了越来越大的作用,成为研究热点之一。本文对PCR技术在牛羊肉制品的成分鉴定及掺假鉴别中的研究进展进行了综述。
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冰淇淋菌落总数实时荧光光电快速检测方法的建立与初步应用
随着人们生活水平的不断提高,微生物对食品的污染也相应地成为食品安全中备受关注的突出问题。在食品生产、加工、包装、储存、运输和销售的各个环节中都有污染微生物的可能。一旦污染,微生物将大量繁殖而引起食品腐败变质,或导致食源性感染或食物中毒。目前传统的微生物检测方法主要是形态检查和生化方法,虽然其灵敏度和特异性较高,但所涉及的实验较多、操作繁琐、需要时间较长、准备和收尾工作繁重,仍然是劳动密集型工作。所以准确、省时、省力的快速微生物检测方法已是社会的迫切需要。
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北京良润生物科技有限公司PCR系列新品正式发布
11月2日,北京良润生物科技有限公司研发的MicroFast?实时荧光(RT)-PCR快速检测系统首次对外发布。该系统配备了16孔实时荧光便捷PCR检测仪及实时荧光(RT)-PCR检测试剂盒。
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美凯纯简便快速的微生物检测
微生物实时荧光光电检测技术是近年来新兴的细菌、霉菌、酵母菌快速检测技术.它将改进后的传统培养分离技术、染色技术、传感和荧光检测技术以及计算机控制的模块化技术合为一体,大大简化了传统微生物的检测方法,将检测时间从数天缩短为数小时.其代表产品BioLumix全自动实时微生物荧光光电检测系统正是基于上述技术推出的一种全自动检测系统.
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实时荧光单引物等温扩增检测阪崎克罗诺杆菌方法的建立
目的 建立实时荧光单引物等温扩增(SPIA)检测阪崎克罗诺杆菌的方法.方法 本文以阪崎克罗诺杆菌OmpA基因特异序列为靶序列,设计RNA-DNA组合引物和链终止序列,优化反应体系,对4株不同来源阪崎克罗诺杆菌和21株其他食源性致病菌进行实时荧光SPIA特异性分析,通过不同浓度梯度阪崎克罗诺杆菌菌悬液灵敏度的检测和添加有阪崎克罗诺杆菌的婴儿配方奶粉样品检出限的确定,评价方法的准确度.结果 除4株阪崎克罗诺杆菌外,其他细菌均未出现特异性荧光扩增曲线,具有良好的特异性.在40 min内,实时荧光SPIA检测阪崎克罗诺杆菌纯培养基因拷贝灵敏度为每反应1 copies,相应活菌数为1.6×10-1 cfu/ml;对婴儿配方奶粉模拟样品中阪崎克罗诺杆菌的检出限是1.5×100 cfu/100 g.结论 本研究建立的方法具有灵敏度高、特异性强、耗时短、操作简单等优点,适用于实验室快速检测阪崎克罗诺杆菌OmpA基因.
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一起老年公寓诺如病毒感染引发胃肠炎疫情的检测与分析
目的:对某社会福利院老年公寓发生的一起急性老人群体性肠胃炎疫情中采集的标本采用实时荧光PCR方法(RT-PCR)进行诺如病毒核酸检测。方法采集该老年公寓患病老人、护理人员的肛拭子共8份。结果本次疫情中,在5份患病老人和2份护理人员的肛拭子标本中检出诺如病毒Ⅱ型(GⅡ)。结论本次疫情爆发蔓延可能是由于带病上班的工作人员在护理和分发餐点过程中将诺如病毒传染给老人并引起交叉感染所致。
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TaqMan 荧光 PCR 技术在霍乱弧菌毒力基因检测中的应用
目的 利用快速灵敏的 TaqMan 实时荧光定量 PCR 方法 检测分离到的 81 株霍乱弧菌的毒力基因.方法 根据霍乱弧菌毒力基因 ctxAB 和 zot 分别设计特异性引物和探针,在对 2 组引物和探针进行灵敏度、特异性和重复性评价的基础上对分离到的菌株进行毒力基因的检测. 结果 81 株霍乱弧菌中,有 20 株菌(24.7 %)产 CT 毒素,来自于外环境的有 19 株;25 株菌(30.9 %)携带zot毒素基因;5 株菌(6.2 %)CT 阴性而 zot 毒素基因阳性.使用这两套系统检测其他肠道致病菌无交叉反应,检测限可达到 2~20 cfu/ml.结论 本研究所采用的 TaqMan 荧光定量 PCR 检测霍乱弧菌毒力基因灵敏度高,特异性好,为今后霍乱日常监测和疫情应急处理提供快检的平台.
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严重急性呼吸综合征实验室的生物安全管理
2003年3月1日,北京市出现首例严重急性呼吸综合征(SARS)患者,我中心便正式开始了该病的实验室检测工作.2003年3~6月,共检测SARS标本数千份,有的标本病毒含量高达105拷贝;检测方法有细胞培养、电镜、PCR、实时荧光PCR、免疫荧光实验、酶联免疫吸附实验等.由于条件所限,这些实验均在二级生物安全实验室中完成,甚至是早期的病毒分离、阳性毒株的培养及鉴定.由于我们实验室科学、严格的生物安全管理制度,未出现人员感染、样品污染及环境污染等事故.我们积累了一些经验或心得,对今后出现的其他病原未明、传播机制不清、生物安全等级不明疾病的研究,尤其对那些尚无P3实验室的单位有着很好的借鉴意义.
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实时荧光PCR检测病原真菌方法的建立及其临床应用
近年来条件致病性真菌感染日益增多,其发病率和死亡率都呈明显上升趋势,由于深部真菌感染初期症状不明显,临床表现缺乏特征性,致使早期明确诊断十分困难,患者生前确诊率相当低,是影响患者预后的重要因素.传统真菌感染的临床鉴定主要依赖于镜检和培养,但这些方法存在周期长、阳性率低的缺点.
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染料法实时荧光PCR检测慢性乙型重型肝炎患者外周血克隆特异性αβT淋巴细胞
以染料法(SYBR Green I)实时荧光PCR并结合基因熔解曲线峰形来监测慢性乙型重型肝炎(慢乙重肝)患者(健康献血者为对照)外周血T细胞受体B链基因(TCRBV)克隆特异性扩增情况,从而可能反映慢乙重肝患者对HBV感染的免疫应答状态.
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RT-PCR酶联杂交法定量测定人PBMC中的IL-1βmRNA
IL-1β是由淋巴细胞和非淋巴细胞分泌的一种细胞因子,除参与免疫调控、神经内分泌及抗肿瘤等多种生理过程外,并与发热、炎症以及某些疾病的病理变化有关,因而在临床及科研中,很多情况下需要了解IL-1β mRNA的表达水平[1].目前,主要采用点杂交、RT-PCR标准曲线法及实时荧光PCR等对IL-1β mRNA进行定量.这些方法,仍存在着某些不足,本研究利用特制的DNA结合板,设计了一种酶联夹心杂交方法,能简便、准确地对RT-PCR扩增后的人外周血单个核细胞(PBMC)中的IL-1β mRNA进行定量.
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实时荧光PCR快速检测沙门菌
60份食品样本同时用常规国标法、科玛嘉平板分离法和实时荧光PCR法进行沙门菌检测研究.按国标GB/T4789.4-2003对60份食品样本进行沙门菌检测,在分离培养的同时将增菌液划线于科玛嘉沙门菌显色平板,挑可疑菌落(紫色或紫红色)进一步试验,所有分离菌株用SENSITITRE微生物鉴定分析系统进行生化鉴定.用Invitrogen提取试剂盒提取细菌DNA,具体方法按说明书操作,鼠伤寒沙门菌作为参考菌株经纯培养后制成菌悬液,同时提取DNA.
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实时荧光PCR检测非HIV感染人群肺孢子菌核酸载量
肺孢子菌肺炎是一种由耶氏肺孢子菌引起的呼吸系统机会性感染,见于免疫功能低下或缺陷者~([1-2]).近年来,接受高效抗逆转录病毒治疗(HAART)和肺孢子菌肺炎预防措施的HIV感染发生肺孢子菌肺炎的概率明显减少[1,3],但随着癌症患者、器官移植者、老年患者、先天性或获得性免疫缺陷及因其他疾病而接受免疫抑制剂者等其他肺孢子菌肺炎高危人群的扩大,临床肺孢子菌肺炎患者日趋增多~([4-5]).鉴于肺孢子菌肺炎患者的临床症状、体征、X线胸片及常规实验室检查均无特异性,病原体检出率较低,血清抗体检测因健康人群抗耶氏肺孢子菌抗体阳性率较高而无临床意义等,肺孢子菌肺炎的早期诊断比较困难.
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真空泵法与离心法提取病毒RNA的效果比较
在应对某些重大传染病如SARS、手足口病、甲型H1N1流感时,由于实时荧光RT-PCR法具有快速、灵敏的特点,在中国CDC系统内被广泛运用,为及时检测诊断提供了帮助[1-2].
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SYBR green Ⅰ实时荧光PCR结合熔解曲线检测HBV B和C基因型的研究
国内外研究表明HBV基因型与病毒的感染途径、基因突变、疾病进程、抗病毒药物疗效有一定的关系[1-3]引,了解HBV基因型分布,追溯感染源对判断预后、监测抗病毒用药疗效、选择个体化治疗方案等具有重要应用价值.目前根据全基因序列同源性>92%或S区基因序列同源性≥96%,HBV分为A~H 8个基因型,在亚洲主要是A~F[4],国内主要基因型为B和C型.
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G蛋白偶联受体激酶4基因多态与原发性高血压关联研究
人类G蛋白偶联受体激酶4基因定位于染色体4p16.3参与机体对血压的调控.本研究采用等位基因特异性聚合酶链反应(PCR)结合实时荧光分析的方法,对中国江苏南通地区93例健康人,102例原发性高血压患者的G蛋白偶联受体激酶4基因变异(GRK4γ)多态位点A486V进行基因分型,探讨GRK4基因多态与原发性高血压的相关性.
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GRK4基因多态A486V与原发性高血压关联研究
我们采用等位基因特异性PCR结合实时荧光分析的方法,对中国江苏南通地区326例健康人和342例高血压患者的GRK4基因多态位点A486V进行基因分型,探讨GRK4基因多态与原发性高血压的相关性.
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实时荧光环介导恒温扩增检测无乳链球菌方法的建立与评价
目的 建立实时荧光环介导恒温扩增(Rea-LAMP)快速检测无乳链球菌的方法,为无乳链球菌的快速检测提供一种新的方法.方法 针对无乳链球菌纤连蛋白fbsB基因的6个区域设计6条特异性引物,利用链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)恒温反应60 min,通过荧光信号实时检测无乳链球菌.结果 研究的反应体系在使用引物1时,扩增效果好;在10株相关菌株的检测中,除无乳链球菌出现很好的阳性外,其余菌株均为阴性;本研究检测无乳链球菌DNA的灵敏度可达到300 pg/μl.结论 Rea-LAMP检测无乳链球菌的特异性强、稳定性高、操作简便快速,具有较大的推广应用前景,可用于无乳链球菌的快速检测.