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实时荧光单引物等温扩增检测阪崎克罗诺杆菌方法的建立
目的 建立实时荧光单引物等温扩增(SPIA)检测阪崎克罗诺杆菌的方法.方法 本文以阪崎克罗诺杆菌OmpA基因特异序列为靶序列,设计RNA-DNA组合引物和链终止序列,优化反应体系,对4株不同来源阪崎克罗诺杆菌和21株其他食源性致病菌进行实时荧光SPIA特异性分析,通过不同浓度梯度阪崎克罗诺杆菌菌悬液灵敏度的检测和添加有阪崎克罗诺杆菌的婴儿配方奶粉样品检出限的确定,评价方法的准确度.结果 除4株阪崎克罗诺杆菌外,其他细菌均未出现特异性荧光扩增曲线,具有良好的特异性.在40 min内,实时荧光SPIA检测阪崎克罗诺杆菌纯培养基因拷贝灵敏度为每反应1 copies,相应活菌数为1.6×10-1 cfu/ml;对婴儿配方奶粉模拟样品中阪崎克罗诺杆菌的检出限是1.5×100 cfu/100 g.结论 本研究建立的方法具有灵敏度高、特异性强、耗时短、操作简单等优点,适用于实验室快速检测阪崎克罗诺杆菌OmpA基因.
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甲型副伤寒杆菌ompA基因分布及重组表达产物的免疫学鉴定
目的 构建甲型副伤寒杆菌ompA基因原核表达系统,确定其重组表达产物rOmpA免疫原性和保护作用,检测甲型副伤寒杆菌临床菌株ompA基因携带率.方法 采用PCR从甲型副伤寒杆菌临床株JH01中扩增ompA基因,T-A克隆后测序并构建ompA基因原核表达系统.采用SDS-PAGE和Bio-Rad凝胶图像分析系统检测rOmpA表达情况及其产量,采用免疫扩散法、微量肥达试验和Western blot鉴定其抗原性和免疫反应性.采用PCR检测98株甲型副伤寒杆菌临床菌株ompA基因携带率.采用小鼠感染模型,了解rOmpA对甲型副伤寒杆菌50001株感染的免疫保护作用.结果 与报道的相关序列比较,所克隆的ompA基因核苷酸和氨基酸序列相似性均为100%.rOmpA表达量约为细菌总蛋白的65%.rOmpA能与其兔抗血清和甲型副伤寒杆菌全菌抗血清产生免疫反应(Western blot),并可在家兔中诱导产生抗体.94.9%(93/98)甲型副伤寒杆菌临床菌株含有ompA基因.100 μg和200 μg rOmpA对感染小鼠的免疫保护率分别为41.7%(5/12)和58.3%(7/12).rOmpA免疫小鼠或保护试验存活小鼠血清对各副伤寒杆菌H抗原的凝集效价为1:5～1:40.结论 ompA基因在甲型副伤寒杆菌临床菌株中分布广泛.rOmpA有良好的免疫原性和一定的免疫保护作用,可考虑为甲型副伤寒杆菌基因工程疫苗候选抗原.
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问号钩端螺旋体ompA基因分析及其重组表达产物的免疫学鉴定
目的 了解我国15群15株问号钩端螺旋体(简称问号钩体)参考标准株携带ompA基因情况,重组表达OmpA(rOmpA)并鉴定rOmpA的免疫原性和免疫保护性.方法 采用酚-氯仿法提取问号钩体基因组DNA,PCR扩增全长ompA基因,T-A克隆后测序.构建问号钩体黄疸出血群赖型56601株ompA基因的原核表达系统,采用SDS-PAGE及Bio-Rad凝胶}冬{像分析系统检测rOmpA表达情况及其产鼍.rOmpA免疫家兔以获得抗血清,采用免疫扩散试验检测抗血清效价.采用Western blot检测rOmpA与其抗血清和问号钩体56601株全菌抗血清的免疫反应性,显微镜凝集试验(MAT)检测rOmpA抗血清对15株问号钩体的交叉凝集情况.分别采用问号钩体黏附J774A.1细胞模型和豚鼠感染模型,了解rOmpA兔抗血清黏附阻断及rOmpA免疫保护作用.结果 15株问号钩体均含有序列保守的ompA基因,双曲钩体Patocl株则否.rOmpA表达量约占细菌总蛋白的20%.rOmpA能诱导家兔产生抗体,其抗血清免疫扩散效价为1:4.兔抗血清及问号钩体56601株全菌抗血清均能与rOmpA产生阳性Western blot信号.rOmpA抗血清对15株问号钩体的MAT效价为1:20～1:320.1:10～1:160稀释的rOmpA抗血清均能阻断问号钩体黏附J774A.1细胞,100μg和200μg rOmpA对豚鼠的免疫保护率分别为50.0%和75.0%.结论 ompA基因仅存在于不同血清群致病性问号钩体基因组中.rOmpA具有较好的抗原性,多种免疫学方法 检测显示,有可能作为通用型问号钩体基因上程疫苗的候选抗原.
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OmpA-VS2为靶基因的非标记实时荧光PCR检测沙眼衣原体感染
目的 建立一种以OmpA-VS2为靶基因的非标记实时荧光聚合酶链反应(PCR)方法,以检测沙眼衣原体.方法 设计15种型别沙眼衣原体通用引物,对OmpA-VS2进行套式PCR扩增和实时荧光PCR检测,并对其敏感性、特异性进行评价,并用临床标本进行验证.结果 15种型别沙眼衣原体均扩增出168bp的目的片段;敏感性为每个反应1个拷贝.特异性分析可见,与10种泌尿生殖道病原体和共生菌均没有交叉反应.临床标本验证的结果显示,该方法与以质粒为靶基因的核酸扩增检测的Amplicor CT/NG方法的检测结果一致.结论 该方法具有敏感性高、特异性强、扩增后无需PCR后处理等特点,可望用于临床与防治项目中沙眼衣原体的检测.
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男性生殖道沙眼衣原体血清分型及其ompA基因变异分析
目的 了解男性生殖道沙眼衣原体感染患者沙眼衣原体血清型分布及其主要外膜蛋白编码基因ompA基因变异情况.方法 收集2011年12月至2013年3月首都医科大学附属北京同仁医院泌尿门诊疑似生殖道沙眼衣原体感染的男性患者送检的生殖道分泌物标本399份,使用沙眼衣原体检测试剂盒进行初筛,将初筛阳性标本进行巢式PCR扩增其ompA基因并测序,测序产物使用BLAST比对分型,并使用MegAlign程序进行比对.结果 399份标本中检测出沙眼衣原体的标本有59份,沙眼衣原体检出阳性率为14.8%(59/399).59份阳性标本均成功分型,其中E型17份(28.8%),F型16份(27.1%),D型13份(22.0%),G型5份(8.5%),H、K型各3份(5.1%),J型 2份(3.4%);其中血清型D型临床株ompA基因突变多(9株),且多为有意义突变,其次为G型(5株).结论 男性生殖道沙眼衣原体血清型以E、F、D型为主;其中血清型D型ompA基因变异多.
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奶牛流产鹦鹉热衣原体ompA基因的克隆与原核表达
目的 表达奶牛源鹦鹉热衣原体ompA基因,探索其作为诊断抗原的可能性.方法 采用套式PCR方法扩增出了奶牛源鹦鹉热衣原体ompA基因完整片段,此扩增产物经过双酶切后克隆到表达载体pGEX-4T-1中,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达后采用SDS-PAGE和Western-blot检测重组目的蛋白的表达结果.结果 重组蛋白经奶牛衣原体阳性血清鉴定正确.结论 ompA基因在原核表达系统中得到正确表达.
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广东连平县存在新的蜱传斑点热立克次体
目的 对采自广东省连平县的3种硬蜱进行蜱传斑点热立克次体检测分析.方法 斑点热立克次体的ompA基因片段扩增并测定扩增片段的DNA序列.结果 20只蜱分为17组,其中15组PCR检测阳性.对4个测序成功的标本进行聚类分析,证实其中3个序列单独聚为一类,与引起Flinders岛蜱传斑点热的弗诺立克次体(R.honei)、非洲蜱咬热的非洲立克次体(R.africa)、未定名斑点热的斯洛伐克立克次体(R.slovaca)以及西伯利亚立克次体BJ-90株等亲缘关系较近,另一序列与我国长白山地区检测到的JL-02具有较高的同源性.结论 本研究提示该地区除了已证实的西伯利亚斑点热外,还存在新的蜱传斑点热.
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赖型钩端螺旋体OmpA膜蛋白Loa22基因的克隆分析及蛋白表达
目的分析赖型钩端螺旋体OmpA膜蛋白Loa22的结构特征,并对其进行克隆表达.方法分别以问号状赖型钩体017株、56601株及双曲状钩体PatocI株基因组为模板PCR扩增目的基因.构建Loa22基因与质粒pGEX-4T-1的重组原核表达质粒,克隆筛选并测序.利用Bioedit、Dnaman、PSIPRED、NCBI及SignaIP等对其结构进行分析.后在大肠杆菌JM109中诱导表达目的蛋白.结果不同毒力赖型钩体均能扩增出约600bp的片段,而PatocI株则未能扩增出目的片段;PCR、双酶切及测序证实pGEX-Loa22构建成功:分析显示不同赖型钩体的Loa22的同源性很高,C末端都具有同OmpA一致的保守序列及肽聚糖相关基序,都有信号肽序列;表达产物经SDS-PAGE检测证明是目的蛋白.结论赖型钩体具有编码OmpA膜蛋白的Loa22基因,可能与赖型钩体毒力和免疫原性存在某种相关性.
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食源性阪崎肠杆菌的双重PCR检测方法研究
目的:建立食品中阪崎肠杆菌双重PCR检测方法.方法:以食品中污染的阪崎肠杆菌为研究对象,以其基因组16 S rRNA-23 S rRNA的内部转录间隔区(ITS)基因和外膜蛋白A(OmpA)基因为靶标选择引物,进行双重PCR扩增,产物用琼脂糖凝胶电泳检测.结果:在优化的双重PCR条件下,阪崎肠杆菌的ITS基因和OmpA基因均可得到有效扩增,方法的灵敏度为1.6×102cfu/mL.所建立的方法用于实际食品样品检测,结果稳定.结论:本研究所建立的方法特异好、灵敏较高、分析周期短、结果准确,可用于食品中阪崎肠杆菌的日常检测.
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沙眼衣原体ompA基因真核表达载体的构建及在HeLa细胞中的表达
目的构建沙眼衣原体(Ct)ompA基因真核表达重组质粒,利用脂质体体外转染HeLa细胞,为核酸疫苗的研制作准备.方法应用PCR技术从D型Ct基因组中扩增ompA全长基因,重组入pUCm-T克隆载体.将pUCm-T/ompA中的ompA外源基因片段经酶切、连接等反应,亚克隆人pcDNA3.1真核表达载体的相应位点,进行序列分析和酶切鉴定后,运用脂质体将重组体pcDNA3.1/ompA转染HeLa细胞,免疫组化法观察目的基因的表达.结果PCR扩增得到约1.2kb的特异性ompA基因片段;序列测定证实与发布序列一致;构建得到真核表达重组体;重组质粒pcDNA3.1/ompA在HeLa表达MOMP.结论Ct ompA基因能够在体外真核细胞中表达,为进一步研究CtDNA疫苗以及研究该蛋白的生物学功能提供实验基础.
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黑龙江林区野鼠中斑点热群立克次体的核酸检测与序列分析
目的:了解黑龙江林区野鼠中斑点热群立克次体的感染情况.方法:运用聚合酶链反应方法对黑龙江地区采集的啮齿动物标本扩增斑点热群立克次体外膜蛋白A(OmpA)基因.阳性标本送测序并应用Mega5.0软件进行序列分析.结果:共检测鼠标本514份,斑点热群立克次体的阳性率为9.3％(95％CI:7.1％～12.2％),牡丹江、绥芬河、同江和东宁四个地区斑点热群立克次体的阳性率分别为12.4％(39/314),5.3％(3/57),2.0％(1/51),5.4％(5/92),地区间阳性率差异有统计学意义(P=0.023).感染斑点热群立克次体的有仓鼠、大仓鼠、大林姬鼠、褐家鼠、黑线姬鼠、红背(鼲)、鼩鼱、棕背(鼲)、东方田鼠、明纹花松鼠10种,鼠种间阳性率差异有统计学意义(P=0.002);棕背(鼲)的阳性率高,为22.1％(21/95).测序结果显示鼠感染的斑点热群立克次体基因型是黑龙江立克次体基因型和一种新的未定种基因型.结论:黑龙江地区存在鼠感染黑龙江立克次体,同时可能存在未定种的新的斑点热群立克次体.
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沙眼衣原体ompA真核表达重组体的构建及鉴定
目的扩增D型沙眼衣原体ompA基因,构建真核表达重组质粒,为核酸疫苗的研制做准备.方法用PCR技术从D型Ct基因组DNA中扩增ompA基因片段,重组入pUCm-T克隆载体.将pUCm-T/ompA中的ompA外源基因片段经酶切、连接等反应,亚克隆入pcDNA3.1(+)真核表达载体,再经含氨苄青霉素的LB培养基筛选,酶切、PCR扩增及测序鉴定.结果从D型Ct基因组DNA中扩增出特异的ompA基因片段,筛选出pUCm-T/ompA;经亚克隆,筛选鉴定出pcDNA3.1(+)/ompA重组质粒.结论成功地构建了pUCm-T/ompA重组质粒和pcDNA3.1(+)/ompA重组质粒,为Ct核酸疫苗的研制提供实验基础.
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沙眼衣原体ompA基因克隆及其在真核细胞中的表达
目的克隆D型沙眼衣原体(Ct)ompA基因,构建真核表达重组质粒,转染真核细胞,为核酸疫苗的研制作准备.方法用PCR技术从D型Ct基因组DNA中扩增ompA基因片段,重组入pUCm-T克隆载体.将pUCm-T/ompA中的ompA外源基因片段经酶切、连接等反应,亚克隆入pcDNA3.1真核表达载体,进行序列分析和酶切鉴定后,运用脂质体将重组体pcDNA3.1/ompA转染HeLa细胞,免疫组化法观察目的的基因的表达.结果从D型Ct基因组DNA中扩增出特异的ompA基因片段;序列测定证实与GenBank登陆的D型Ct一致;重组质粒pcDNA3.1/ompA在HeLa中获得表达.结论Ct ompA基因能够在体外真核细胞表达,为进一步研究Ct致病机制及DNA疫苗的研究提供理论依据.
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斑点热群立克次体广东分离株OmpA基因片段的克隆及序列分析
目的鉴定斑点热群立克次体广东分离株GDFK58-2000和GDFK59-2000种属类型.方法用PCR方法扩增GDFK58-2000和GDFK59-2000的OmpA基因起始部位533 bp片段,克隆于pMD18-T载体并进行测序,测序结果与Genbank中其它斑点热群立克次体相应基因片段的核苷酸进行比较,用DNASTAR软件分析结果.结果 GDFK58-2000、GDFK59-2000和西伯利亚立克次体之间的核苷酸同源性为99.6%～99.8%,推断的氨基酸同源性为99.6%～99.8%,常用于分类鉴定的酶切位点完全一致.结论两株广东分离株属于斑点热群立克次体的西伯利亚立克次体种.
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LAMP法和PCR法快速检测阪崎肠杆菌的比较
[目的]建立阪崎肠杆菌环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)快速检测技术,并与PCR检测方法进行比较,为阪岐肠杆菌感染的快速诊断提供实验依据.[方法]根据阪崎肠杆菌外膜蛋白OmpA基因,设计特异性引物,建立LAMP和PCR检测技术体系,并对2种方法检测的灵敏度、特异性和实际样品的检测结果进行比较.[结果]建立了优化的LAMP和PCR检测体系,灵敏度检测结果显示,LAMP检测限为101 cfu/ml,PCR检测限为102 cfu/ml,LAMP检测灵敏度高于PCR;对36株近源菌进行特异性检测,结果显示,LAMP仅8株阪崎肠杆菌得到阳性结果,PCR产物则出现非特异性条带,LAMP特异性比PCR高.应用于46份奶粉样品的检测,LAMP和PCR均有清晰、特异的预期条带和结果产生,并与常规检测结果一致.[结论]LAMP检测技术作为一种快速检测阪崎肠杆菌的方法具有简便、灵敏快速,与PCR方法比较,特异性强、操作简便、检测成本低,耗时短,更有望发展成为快速检测阪岐肠杆菌的有效手段.
