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双重PCR检测生鲜猪肉中大肠杆菌O157∶H7和沙门菌方法的建立与应用
目的 建立生鲜猪肉中大肠杆菌和沙门菌的双重PCR检测方法,并初步调查生鲜猪肉中大肠杆菌和沙门菌的污染情况.方法 以大肠杆菌0157∶H7 rfbE基因和沙门菌invA基因为靶基因设计引物.通过对单个基因PCR和多重基因PCR扩增进行特异性、敏感性试验以及优化反应体系,建立快速检测大肠杆菌和沙门菌的双重PCR法.在郑州市不同地区的综合性超市、冷鲜肉专卖店和农贸市场随机抽检144份生鲜猪肉样品,分别进行了PCR检测和常规微生物学检验.结果 建立的双重PCR方法特异性好,抗干扰能力强,灵敏度可达到10 pg/μl.在144份样品中检测出大肠杆菌的样品数为10份,检出率为6.94％;检出沙门菌的样品数为13份,检出率为9.03％;大肠杆菌和沙门菌同时检出的有2份,占总样品的1.39％.结论 初步建立了同步、简便、快速、灵敏地检测生鲜猪肉中大肠杆菌、沙门菌的双重PCR方法;生鲜猪肉中存在致病菌的污染问题,将威胁到食品安全和人体健康,不容忽视.
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淋病奈瑟菌pI优势基因型及其G120/A121突变与耐药性关系
目的 分析浙江省上虞地区淋病奈瑟菌临床菌株外膜孔蛋白优势基因型及其G120和A121突变与耐药性关系.方法 建立能同时检测pIA和pIB基因的双重PCR.目的 扩增产物T-A克隆后测序,以分析G120和A121突变情况及证实双重PCR的检测特异性.采用酸性纸片法和二倍琼脂稀释法,分别检测pIA~+和pIB~+菌株产β-内酰胺酶情况以及对6种抗生素的耐药性.结果 多重PCR可准确地对所有受检淋病奈瑟菌临床菌株进行porin I(pI)基因分型,其检测灵敏度为1 ng DNA模板.116株淋病奈瑟菌临床菌株中,30.2%(35/116)为pIA~+菌株,69.8%(81/136)为pIB~+菌株.所有pIA~+菌株出现G120D/A121G双突变(88.6%)或A121G单突变(11.4%),98.8%pIB~+菌株出现G120K/A121D(65.0%)、G120K/A121G或G120N/A121D(13.8%)双突变以及G120D/N/K单突变(21.3%).34.5%(40/116)菌株产β-内酰胺酶,其中pIA+菌株产酶率(20%)明显低于pIB~+菌株(40.7%)(P＜0.05).上述临床菌株对青霉素、四环素、环丙沙星和阿奇霉素耐药率高达75.0%～90.5%,仅有3株菌株对头孢曲松耐药,未发现大观霉素耐药菌株.100%和71.4%不产β-内酰胺酶、G120和/或A121突变pIA~+菌株分别对青霉素和四环素敏感,但不产β-内酰胺酶G120和/或A121突变的pIB~+菌株对该2种抗生素耐药率均为100%.结论 所建立的多重PCR可用于淋病奈瑟菌pI基因快速和准确分型.上虞地区流行的淋病奈瑟菌主要携带pIB基因.大观霉素和头孢曲松仍可作为治疗淋病的首选药物.G120和/或A121突变增强对青霉素和四环素耐药性仅限于pIB~+菌株.
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南方养殖草鱼呼肠孤病毒的分子特性比较及双重PCR检测方法的建立
本实验室2009年从广东省患典型出血病的养殖草鱼中分离到一株具强致病性的水生呼肠孤病毒GCRVGD108株,该毒株具有11个节段双链RNA.全基因组序列分析显示与草鱼呼肠孤病毒GCRV及水生呼肠孤病毒属其它已知种存在较大的分子差异.本研究进一步检测了广东、福建、湖南等地草鱼出血病流行毒株的分子特性.根据已克隆到的GCRV-GD108株11个节段序列分别设计合成特异引物,从各地收集患出血病草鱼,提取组织总RNA,RT-PCR检测.结果表明各检测样品均可扩增到特异性条带,而GCRV标准株则无特异条带；同时根据GCRV标准株序列合成的特异引物进行扩增,GCRV标准株有特异性条带,而各检测样品则均无带.测序结果显示各样品间相应片段序列的同源性很高(95.2％～99.4％),与GCRV-GD108的相应序列也具高同源性(95.0％～99.8％),说明检测样品与GCRV-GD108株具有相似的分子特性,均与GCRV及水生呼肠孤病毒属的其它种存在较大差异.本研究结果提示我国养殖草鱼出血病病毒存在着不同的分子类型,GCRV-GD108株在南方具有一定的代表性,在病害防控上尤其是疫苗研制与使用上应予关注.此外,从上述引物中筛选出适合于双重PCR的引物对,建立了双重PCR检测方法,可在一次PCR反应中鉴别所感染的病毒属于GCRV或GCRV-GD108株.
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双重PCR检测气道肺泡灌洗液在军团菌肺炎早期诊断中的意义
为探讨采用双重PCR方法(DPCR)检测支气管肺泡灌洗液(BALF)标本中军团菌DNA在早期诊断军团菌肺炎方面的意义,采用DPCR方法对军团菌肺炎组(8例)、临床表现类似军团菌肺炎组(15例)、普通肺炎组(16例)、肺结核组(10例)和肺癌组(15例)五组患者留取的BALF标本进行检测.军团菌肺炎组的DPCR阳性检出率为100%,明显高于其它四组(分别为13.33%,0%,0% ,0%),(均P＜0.01).模拟BALF标本DPCR的低检出限为1×103 cfu/mL.采用DPCR方法检测BALF标本中的军团菌DNA具有较好的敏感性和特异性,此法在临床早期诊断军团菌肺炎方面具有一定的价值.
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双重PCR和RAPD技术在宁夏鼠疫菌鉴定中的应用研究
目的 应用多重PCR和RAPD结合鼠疫常规检测方法对可疑鼠疫菌和自毙鼠脏器进行鉴定,应用多种实验室检测方法联合检测和鉴定鼠疫菌,为科学、快速、有效地判定鼠疫疫情提供实验室支持.方法 采用双重PCR对2009年宁夏2个鼠间鼠疫监测点分离获得的可疑菌株和部分自毙鼠脏器进行目标基因fra和pla片段扩增,并利用RAPD技术对2个监测点分离获得的鼠疫菌进行随机引物扩增基因表征分析.结果 共分离获得16株菌,所有菌株扩增出2条目标条带,分别为249 bp和456 bp.自毙鼠脾脏扩增出目标基因,肝脏扩增的目标基因条带较弱.RAPD显示所有菌株的扩增条带一致,表明此次分离得到的鼠疫菌株未发生变异.结论 双重PCR可作为实验室快速诊断和迅速判定鼠疫疫情的有效方法,用RAPD法筛选的鼠疫菌扩增的随机引物可为确定宁夏分离鼠疫菌株的标识图谱提供参考.
关键词： 鼠疫菌鉴定 双重PCR 随机扩增多态性DNA(RAPD) -
鹅细小病毒、鹅副粘病毒双重PCR检测方法的建立
目的 建立用于鹅细小病毒(GPV)和鹅副粘病毒(GPMV)快速鉴别的双重PCR检测方法. 方法 根据2种病原体的基因保守序列,分别设计与GPV的VP3和GPMV的F基因互补的2对引物,对混合样品中GPV的DNA及GPMV反转录后的cDNA模板进行双重PCR扩增.应用该方法对黑龙江省9市(县)GPV、GPMV病毒病的疑似病料进行检测. 结果 对cDNA模板进行双重PCR扩增得到与试验设计相符的574 bp(GPV)和884 bp(GPMV)2条特异性扩增带.双重PCR可以检测到1.32 ng/L的GPMV和298 ng/L的GPV核酸模板,DPV扩增结果为阴性.检测7个市(县)的发病鹅群均为鹅GPV感染,未检出GPMV. 结论 双重PCR方法是一种快速、敏感、特异的检测方法,可用于家禽GPV和GPMV感染.
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一种基于双重PCR结合毛细管电泳验证转录组测序结果的新方法
目的：将双重PCR与毛细管电泳技术相结合，建立一种验证转录组测序结果的新方法。方法根据前期进行转录组测序的分析结果，挑选8个差异基因作为靶基因，分别使用双重PCR结合琼脂糖凝胶电泳、双重PCR结合毛细管电泳以及实时荧光定量PCR进行验证，比较三者的验证率。结果双重PCR结合琼脂糖凝胶电泳的验证率为50％；双重PCR结合毛细管电泳和实时荧光定量PCR的验证率均为100％。结论双重PCR结合毛细管电泳可作为转录组测序结果验证的一种有效方法。
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双重PCR法检测痰标本对早期诊断军团菌肺炎的意义
为探讨双重PCR方法(DPCR)检测痰标本中军团菌DNA在早期诊断军团菌肺炎方面的意义 ,采用DPCR方法对军团菌肺炎组、临床疑似军团菌肺炎组、普通肺炎组和肺结核组4组患者留取的痰标本进行检测.DPCR过程采用根据军团菌16SrRNA基因和mip基因设计的2对引物,同时扩增军团菌386 bp 16SrRNA基因片段和206 bp mip基因片段.结果:军团菌肺炎组的DPCR阳性检出率为100 %,明显高于其他3组(分别为17.24%、0、0,P均＜0.01).模拟痰标本DPCR的低检出限为1×103 cfu/mL.初步研究表明,DPCR方法检测痰标本中的军团菌DNA具有较好的敏感性、特异性和稳定性,此法在临床早期诊断军团菌肺炎方面具有一定的价值.
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大鼠细小病毒 H-1株和 KRV 株双重 PCR检测方法的建立及应用
目的：建立大鼠细小病毒H-1和KRV株双重PCR方法并对方法进行初步应用。方法根据NCBI发表的H-1（NC＿001358）和KRV（U790330）基因组序列分别设计特异引物，以H-1和KRV 病毒DNA为模板建立双重PCR方法，对方法进行优化后验证方法的敏感性和特异性；经口感染大鼠，分为H-1和KRV单独感染组和混合感染组，感染后第2，4，6，8，10天采集大鼠粪便，第10天处死所有大鼠，采集心、肝、脾、肺、肾和盲肠内容物等组织，用建立的方法对粪便和组织样本进行检测。结果建立的双重PCR方法以H-1和KRV为模板能够分别扩增出183 bp和302 bp 2个条带，敏感性验证显示能够检测到的低H-1量为3.8 pg／mL，低KRV量为0.73 pg／mL；在以小鼠微小病毒、犬细小病毒和猫细小病毒为模板时无任何条带扩增出，特异性良好。感染第2天在所有大鼠粪便中均检测到病毒核酸，感染大鼠均无明显临床症状，感染第10天采集组织，H-1在各组织的检出率分别是心50％（4／8），肝50％（4／8），脾62.5％（5／8），肺50％（4／8），肾37.5％（3／8），盲肠内容物62.5％（5／8），且单独感染组检出率高于混合感染组；KRV在各组织的检出率分别是心0（0／8），肝25％（2／8），脾87.5％（7／8），肺12.5％（1／8），肾25％（2／8），盲肠内容物62.5％（5／8），混合感染组检出率高于单独感染组。结论建立的H-1和KRV双重PCR方法能够高效的检测大鼠粪便及组织中的病毒感染，可作为实验动物国家标准的有力补充。
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双重PCR检测沙门氏菌和变形杆菌方法的建立
目的:建立快速鉴定腹泻患者粪便标本中沙门氏菌和变形杆菌的双重聚合酶链式反应(PCR)方法.方法:针对沙门氏菌属特异基因invA和变形杆菌属特异基因tuf分别设计特异性引物,将天津某医院肠道门诊腹泻患者粪便标本经SS培养基分离培养后,对可疑菌株同时进行invA-tuf基因双重PCR鉴定和生化鉴定,比较两种方法结果的一致性;对沙门氏菌进一步行血清学分型.结果:双重PCR和生化反应都各自鉴定得到沙门氏菌31株和变形杆菌62株,而且二者鉴定结果完全一致;31株沙门氏菌包括鼠伤寒、肠炎等常见血清型和格兰扁、菲尔摩雷等罕见血清型,均能扩增出283 bp长度片段,62株变形杆菌包括48株奇异变形杆菌、8株普通变形杆菌、2株潘氏变形杆菌、4株产黏液变形杆菌,均能扩增出541bp长度片段.结论:invA-tuf基因双重PCR方法能够快速可靠地鉴定SS培养基上生长的沙门氏菌和变形杆菌.
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鸡毒支原体强毒株与F疫苗株双重PCR检测方法的建立
目的 建立能同时检测MG强毒株和F疫苗株的双重PCR技术.方法 根据鸡毒支原体(MG)R株的PvpA基因序列和F疫苗株假定的α磷酸海藻糖酶基因序列,设计2对引物R1、R2和F1、f2,在单-PCR的基础上,建立检测MG强毒株和F疫苗株的双重PCR方法,并运用该双重PCR方法对临床样品进行检测.结果 在330 bp和444 bp处分别出现预期的特异性DNA扩增条带,敏感性试验显示该体系能检测出0.45 ng的MG R株DNA和0.25 ng的MG F疫苗株DNA.临床样品MG强毒株阳性检出率为79.69%,高于常规分离培养鉴定法.结论 成功建立检测两种毒株的双重PCR技术,为根除鸡群中MG野毒株、建立元MG的阴性鸡群提供新的技术手段.
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儿童百日咳与类百日咳综合征的临床特点分析
目的 探讨儿童百日咳与类百日咳综合征的临床特点.方法 收集2016年2月至2016年10月苏州大学附属儿童医院收治的58例疑似百日咳患儿的呼吸道分泌物,应用Real-time PCR检测百日咳杆菌双目标基因.结果 入组患儿58例,PCR检测阳性患儿27例,阳性率46.6％;未接种百日咳疫苗的有19例(70.4％).≤3月龄组阳性患儿有9例(33.3％);＞3个月龄组阳性患儿有18例(66.7％);百日咳患儿中以阵发性痉咳(85.2％)、面色涨红 (85.2％)和阵发性青紫(22.2％)为主要表现;≤3个月组和＞3个月组百日咳患儿的临床表现比较无明显差异;27例百日咳患儿中,9例(33％)混合有其他病原感染,单纯百日咳组与百日咳混合其他病原感染组的临床表现比较无明显差异;31例PCR阴性患儿中,10例检出肺炎支原体感染,4例检出人鼻病毒感染,2例检出副流感3病毒感染.百日咳组的白细胞、淋巴细胞计数,住院时间明显高于类百日咳组,痉挛样咳嗽、鸡鸣样回声、面色涨红、咳后呕吐、阵发性青紫、并发症及肺部体征比较无明显统计学差异(P＞O.05).结论 未接种百白破疫苗的婴儿博德特百日咳杆菌感染率较高,＞3个月龄组百日咳杆菌感染并不少见,≤3个月组和＞3个月组患儿的临床表现无明显差别;肺炎支原体、人鼻病毒和副流感病毒3是引起类百日咳的主要病原,单纯从临床表现不能区别百日咳与类百日咳.
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横川后殖吸虫与扇棘单睾吸虫双重PCR鉴别方法的建立
目的 建立一种能快速鉴定横川后殖吸虫(Metagonimus yokogawai)和扇棘单睾吸虫(Haplorchis taichui)的双重PCR方法. 方法 从GenBank中获取横川后殖吸虫和扇棘单睾吸虫以及与其同源性较高的虫种的核糖体DNA第一内转录间隔区(ITS1)序列,应用Primer premier 5.0软件设计2对特异性引物,并优化PCR反应体系和反应条件,建立双重PCR法.将横川后殖吸虫和扇棘单睾吸虫与17个相关虫种一起进行PCR扩增,检测方法的特异性.横川后殖吸虫和扇棘单睾吸虫的ITS1扩增产物经pMD19-T载体进行TA克隆获得质粒,并将质粒进行梯度稀释,检测其敏感性.应用新建的双重PCR法鉴定从47副猫内脏和40副犬内脏中收集的吸虫,检测该方法的准确性和实用性. 结果 新建的双重PCR法能扩增出横川后殖吸虫和扇棘单睾吸虫的目的片段,大小分别为648 bp和279 bp,不与钩棘单睾吸虫、华支睾吸虫、心形咽口吸虫、次睾属吸虫囊蚴、外睾属吸虫囊蚴、藐小棘隙吸虫、抱茎棘隙吸虫、弗氏棘口吸虫、似锥低颈吸虫、全冠属吸虫、重盘属吸虫、异尖属线虫、东方次睾吸虫、卫氏并殖吸虫、瓦氏瓦生吸虫、背孔属吸虫和宫脂属线虫的DNA发生交叉扩增,具有较好的特异性.敏感性试验表明,应用该双重PCR法,2类吸虫DNA的低检测值分别为1.49×10-1 pg和1.14×10-1Pg.对来自猫内脏和犬内脏的吸虫检测表明,该方法能够区分横川后殖吸虫和扇棘单睾吸虫,并且不与猫、狗中其他的吸虫DNA发生交叉扩增. 结论 本研究所建立的双重PCR法可用于快速鉴定横川后殖吸虫和扇棘单睾吸虫.
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基于线粒体细胞色素C氧化酶亚单位1基因鉴别华支睾吸虫和扇棘单睾吸虫的双重PCR法的建立
分别提取华支睾吸虫和扇棘单睾吸虫的基因组DNA,针对两种吸虫线粒体细胞色素C氧化酶亚单位1 (COX1)基因设计引物,进行单重和双重PCR扩增.用针对华支睾吸虫的3对引物进行单重PCR扩增,FC1/RC1和FC3/RC3引物分别扩增出328 bp和356 bp的特异性目的条带,而FC2/RC2引物未扩增出任何条带;用针对扇棘单睾吸虫的FH1/RH1和FH2/RH2引物进行单重PCR扩增,分别扩增出200 bp和190 bp的特异性目的条带.用华支睾吸虫FC1/RC1引物,结合扇棘单睾吸虫的FH1/RH1和FH2/RH2引物,分别进行双重PCR扩增,均能扩增出特异性条带,彼此间无干扰.
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APPswe/PS1转基因模型鼠的基因分型与筛选研究
目的 探讨老年性痴呆( Alzheimer disease,AD)转基因模型鼠Tg(APPswe PSEN1 dE9)85Dbo的优化繁育和基因分型方法,筛选出适合AD研究的稳定转基因动物.方法 3种不同的繁殖配伍分组(组1,+/+♂×-/-♀;组2,+/+♀×-/-♂;组3,+/+♀×+/+♂)研究子代鼠的存活率及PS1转基因阳性率;提取子二代鼠尾基因组DNA并鉴定其质量,用双重PCR方法扩增PS1转基因片段,琼脂糖凝胶电泳观察结果;PCR产物测序证实其基因序列.结果 改良后的方法全程耗时不到8h,提取的基因组DNA在23 kb以上,完整性好,浓度为65～175 ng/μl.共繁殖子二代小鼠27窝计222只,存活206只,配伍组1子代存活率94.29％(99/105);配伍组2子代存活率91.67％(66/72);配伍组3子代存活率91.11％ (41/45),3组间存活率差异无统计学意义(P =0.423＞0.05).3种配伍产生的子代鼠转基因阳性率都基本符合孟德尔遗传规律,转基因阳性率差异有统计学意义(P=0.028 ＜0.05).配伍组1子代鼠雄鼠阳性率65.1％ (28/43),雌鼠阳性率35.7％ (20/56),差异有统计学意义(P=0.003 ＜0.05),性别与转基因阳性率相关(CO=0.280,P=0.004 ＜0.05);配伍组2子代鼠,雄鼠阳性率56.3％(18/32),雌鼠阳性率55.9％(19/34),差异无统计学意义(P =0.586 ＞0.05);配伍组3子代鼠,雄鼠阳性率81％(17/21),雌性阳性率65％(13/20),差异无统计学意义(P=0.212 ＞0.05).双重PCR产物经测序证实和预期完全一致.结论 Tg(APPswe,PSEN1dE9)85Dbo杂合子亲代配伍能产生存活至成年的纯合子子代鼠;改进后的基因分型可以作为小鼠基因分型的可靠方法,用于AD研究相关的胎鼠神经元培养实验,该动物模型杂合子雄鼠与野生型雌性鼠的配伍繁殖为佳繁育筛选组合.
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大鼠细小病毒双重PCR检测方法的建立
目的 建立快速检测大鼠细小病毒的PCR方法.方法 根据大鼠细小病毒基因序列的特点,建立鉴别检测大鼠细小病-(RPV)与其他三种大鼠细小病毒(H-1、KRV、RMV)的双重PCR方法.根据RPV核酸序列的性质,在VP2基因筛选了一对用于特异扩增RPV株的引物,在NS1基因设计了一对用于特异性扩增H-1,KRV和RMV的引物.结果 两对引物组成的二重PCR方法可以特异性的扩增RPV而不扩增核酸同源性高的小鼠细小病毒和多种其他病原微生物;敏感性实验表明,二重PCR的低检测限可达1 000拷贝/μL.双重PCR结合测序在检测23份临床样本中,检测出7份RMV阳性,包括1份与RPV共感染阳性样本.结论 本研究建立的检测RPV的双重PCR方法具有特异性好、灵敏度高及操作简单等优点,是一种简便、可靠的检测方法.
关键词： 大鼠细小病毒(RPV) H-1 KRV RMV 双重PCR -
人血浆DNA双重实时荧光定量PCR检测法的建立
目的 建立带有内参照的双重实时荧光定量PCR方法检测血浆DNA含量.方法 构建重组质粒DNA作为内参照物,采用共用下游引物的双重实时荧光定量PCR技术同步扩增人看家基因β-actin和重组质粒载体中人工合成DNA序列,定量检测健康成年人血浆DNA含量.结果 本法能在同一个反应管中对目的基因和内参照进行同步扩增,两者的扩增无相互干扰,特异性好;重组质粒DNA的平均扩增效率达90%,β-actin基因的平均扩增效率接近100%;本法批内变异系数(CV)11%,批间CV17%.结论 成功建立含有内参照的双重实时荧光定量PCR方法,可对血浆DNA进行定量检测.
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食管癌患者血浆循环DNA定量检测及临床特征分析
目的 检测食管癌患者血浆循环DNA的含量并探讨其与临床病理特征之间的关系.方法 采集44例食管癌患者及100例健康对照的外周血,用磁珠法提取DNA、双重实时荧光定量PCR检测血浆DNA含量,并用放免法检测血清CEA水平.结果 食管癌患者血浆DNA含量(中位数:54.0 ng/ml,四分位数区间:38.0～68.1 ng/ml)显著高于健康对照(中位数:18.5ng/ml,四分位区间:15.5～24.9 ng/ml),P<0.001.Ⅱa期、Ⅱb期和Ⅲ～Ⅳ期患者血浆DNA含量分别37.0(27.2～46.2)ng/ml、53.0(41.4～63.7)ng/ml和66.3(55.9～81.8)ng/ml.Ⅲ～Ⅳ期明显高于Ⅱa～Ⅱb期(P=0.003).Ⅱa和Ⅱb期组的血浆DNA含量显著高于健康对照组(P<0.001).高、中分化组和低分化组的血浆DNA含量分别为32.3(24.2～55.1)ng/ml、52.9(42.5～69.6)ng/ml和65.0(57.7～88.6)ng/ml,低分化组显著高于高、中分化组(P=0.010).以32.3 ng/mL作为临界值,血浆DNA诊断敏感性为91.2%,特异性为90.0%,ROC曲线下面积为0.959(95%CI 0.915～1.000),优于血清CEA.结论 检测血浆DNA对食管癌的筛查、早期诊断、判断肿瘤侵袭与转移具有重要价值.
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影响内标双重PCR靶模板检测灵敏度的因素分析
目的 在内标双重PCR系统中寻找影响靶模板检测灵敏度的主要因素,并比较不同检测体系的灵敏度.方法 针对HBV基因设计普通引物对和中部同序引物对,比较引物二聚体(PD)含量;控制内标基因的Ct值约为30,调整内标引物浓度为10、8、5、2、1 μmol/L,比较不同体系的检测灵敏度;控制内标引物的用量不变,分别测定内标基因Ct值在15、20、25、30时的靶模板检测灵敏度.结果 中部同序引物PD的Ct值在35以上,普通引物对PD的Ct值在30～33之间;10、8、5、2、1 μmol/L浓度的内标引物需要内标模板的浓度分别为5×104、5×104、5×104、5×105、5×107 IU/mL;不同内标引物用量检测灵敏度均为5×103 IU/mL,仅使用中部同序引物的单重PCR检测灵敏度为5×102 IU/mL;内标Ct值在15、20、25、30时靶模板检测的灵敏度分别为5×105、5×104、5×103、5×103 IU/mL.结论 在双重PCR检测体系中,对靶模板检测灵敏度影响大的因素为内标的模板量,仅使用中部同序引物对的单重PCR具有高的灵敏度.
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双重PCR快速检测KPC和NDM耐药基因
目的 检测耐药基因的核酸技术,已成为有效监测和控制耐药菌扩散的强有力工具之一.建立一种快速检测KPC和NDM两种耐药基因的方法 ,以指导临床用药和监控院内细菌耐药性流行情况.方法根据肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶(KPC)和新德里金属β-内酰胺酶(NDM)的基因保守区,设计PCR反应的引物,优化扩增体系,建立同时检测耐药基因KPC和NDM的方法,分析方法的灵敏度和特异性,并应用于铜绿假单胞菌和肺炎克雷伯菌株的检测.结果 KPC和NDM基因的序列比对结果与原序列相比一致性为100％.KPC-2阳性标准品和标准菌株肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1705均出现预期大小一致的目的片段(151 bp);NDM-2阳性标准品与NDM阳性肺炎克雷伯菌出现与预期大小一致的目的片段(261 bp),均无非特异性扩增.经对PCR产物进行测序验证,产物序列与耐药基因KPC-2和NDM-1序列一致性为100％.双重PCR检测耐药基因KPC和NDM的低可检测浓度分别为7×102和5×102copies/反应.13株对碳青霉烯耐药的肺炎克雷伯菌株中12株检测到耐药基因,检出率为92.3％,其中KPC阳性10株(83.3％),NDM阳性2株(16.7％),其余10株碳青霉烯敏感的肺炎克雷伯菌株未检测到KPC和NDM;13株铜绿假单胞菌中6株对碳青霉烯耐药的菌株中2株检测到耐药基因,均为KPC,检出率为33.3％,其余7株均未检测到KPC和NDM.结论 双重PCR方法能够快速有效地用于KPC和NDM两种耐药基因的检测,并具有灵敏度高、特异性强等优点,对于指导临床用药与监控院内细菌碳青霉烯类抗生素耐药性的传播具有重要意义.
关键词： 双重PCR 肺炎克雷伯碳青霉烯酶 新德里金属β内酰胺酶
