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母体血浆中游离胎儿DNA研究进展
母血浆中游离胎儿DNA是无创伤性产前诊断中胎儿信息的主要来源之一.近年对游离胎儿DNA的来源、生物学特点以及临床应用的研究倍受关注.现已开展胎儿性别鉴定、RhD基因检测、STR遗传标记检测、胎儿非整倍体检测等应用研究.母血浆中游离胎儿DNA提取方法的发展和高灵敏度检测技术的应用.为母血浆中游离胎儿DNA的研究开辟了新前景.就母血中胎儿DNA来源、生物学特点,分析方法、基础性研究及临床应用的进展情况综述.
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应用孕妇血浆DNA检测胎儿性别的研究
目的探讨应用孕妇血浆中游离DNA进行无创性产前性别诊断的可行性.方法用柱分离法提取26例孕妇血浆中DNA,用巢式PCR技术检测其胎儿性别决定基因(SRY)基因.[ HTH〗结果 26位孕妇中14例孕男胎的孕妇有12例显示阳性条带,12例孕女胎的孕妇 2例有阳性条带,总的准确率为84.6%.结论采用孕妇血浆胎儿DNA和巢式P CR技术可以快速简便地进行无创性产前性别诊断,对性连锁遗传病的预防具有重要意义.
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孕妇血浆DNA中内参基因拷贝数稳定性的评价
目的:探讨孕妇血浆和非孕妇血浆游离DNA中常用内参基因的拷贝数稳定性,为孕妇血浆游离DNA的定量研究提供参考.方法:选择孕龄为12周左右的健康孕妇及健康未孕女性各18名,取外周静脉血并提取血浆DNA,将DNA样本分为孕妇与非孕妇整体组、孕妇组、非孕妇组、母体与胎儿整体组、母源DNA组和胎源DNA组,选取β-珠蛋白(HBB)、端粒酶(TERT)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、白蛋白(ALB)、β-肌动蛋白(ACTB)和T细胞受体γ(TRG)为内参基因.采用实时荧光定量PCR (qPCR)法分析血浆DNA中内参基因Ct值,分别采用3款统计学软件geNorm、NormFinder和BestKeeper比较6种内参基因在各组样本中的拷贝数稳定性.结果:①qPCR法,6种内参基因的所有PCR产物均特异性扩增.各组内参基因Ct值比较差异均无统计学意义(P＞0.05).各组ACTB的Ct值低,HBB次之,即血浆DNA中ACTB和HBB拷贝数高.②按照geNorm软件计算结果基因稳定值(M)由高到低的顺序、NormFinder软件计算结果含量稳定性由高到低的顺序、BestKeeper软件计算结果相关系数(R)由高到低的顺序,在各组样本中将6种内参基因按照其拷贝数稳定性由高到低进行排序.综合分析3种软件的分析结果,在孕妇与非孕妇整体组、孕妇组、非孕妇组、母体与胎儿整体组、母源DNA组和胎源DNA组中,拷贝数稳定性高的内参基因分别为TERT、ACTB、ALB、HBB、HBB及HBB.③母体与胎儿整体组、母源DNA组、母源DNA组和胎源DNA组内参基因的Ct值比较差异均有统计学意义(F=114.84,P＜0.05).结论:当采用qPCR法对来自于孕妇与非孕妇整体、孕妇、非孕妇、母体与胎儿整体、母源DNA和胎源DNA的血浆游离DNA进行定量分析时,推荐分别选择TERT、ACTB、ALB、HBB、HBB及HBB作为校正内参基因.
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血浆 DNA 浓度对急诊重症监护室休克患者预后的预测价值
目的：探讨血浆DNA浓度对急诊重症监护室（ EICU ）休克患者病情及预后的预测价值。方法采用前瞻性、随机对照方法，选择2012－06～2013－12期间入住我院EICU休克患者共69例，分别于入室0、24 h采取外周静脉血，应用实时荧光定量PCR技术定量检测血浆DNA浓度，同时测定血乳酸，以及24 h内急性生理学和慢性健康状况评分Ⅱ（ APACHEⅡ评分）；另选取30例体检者为健康对照组。随访28天生存率，比较28天存活组和死亡组之间不同时相点血浆DNA、乳酸浓度以及24 h APACHEⅡ评分对病情及预后的评估价值。结果患者入室0 h血浆DNA浓度7.66×105（1.61×105～2.06×106） pg／mL和24 h血浆DNA浓度3.91×105（3.47×104～3.88×106）pg／mL，均明显高于健康对照组[9.09×103（4.77×103～8.97×104）pg／mL，P＜0.05]。入室0、24 h存活组与死亡组患者血浆DNA浓度分别为2.85×105（7.20×104～9.35× 105）pg／mL vs 1.91×106（7.81×105～4.60×107）pg／mL、5.74×104（1.12×104～5.97×105）pg／mL vs 3.82×106（1.66×106～9.27×106）pg／mL，差异均有统计学意义（P＜0.05）。入室0 h的血浆DNA曲线下面积为0.822 （ 0.707～0.937），特异度为71.9％，敏感度为75％，佳截断值为8.11×105 pg／mL；入室24 h的血浆DNA曲线下面积为0.861（0.759～0.963），特异度为87.5％，敏感度为80％，佳截断值为1.39×106 pg／mL。多元Logistic回归分析显示，24 h血浆DNA和24 h血乳酸分别是预测休克患者28天死亡率的独立危险因素。结论入室24 h血浆DNA和24 h血乳酸可作为判断休克患者的独立预测因子，且血浆DNA预测价值明显高于乳酸。
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大肠癌患者血浆DNA中K-ras癌基因突变的检测
目的评价血浆DNA中K-ras癌基因第12密码子点突变作为肿瘤标记物的临床应用价值.方法用引物序列特异性聚合酶扩增链式反应(PASP)检测了32例大肠癌患者肿瘤组织DNA、血浆DNA中K-ras癌基因第12密码子点突变,对所有PASP法扩增得到的含点突变的PCR产物进行Sanger双脱氧链终止法测序.结果 14例(44%)大肠癌肿瘤组织DNA中存在K-ras癌基因第12密码子点突变;其中的13例(93%)在血浆DNA中存在与其肿瘤组织DNA相同类型的基因点突变.对于18例肿瘤标本DNA未见突变的各期大肠癌及5例正常献血员对照组,在其血浆DNA中也无一发现K-ras基因突变.结论血浆DNA中K-ras癌基因第12密码子点突变有望成为一个肿瘤标志物应用于大肠癌的诊断.
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人血浆DNA双重实时荧光定量PCR检测法的建立
目的 建立带有内参照的双重实时荧光定量PCR方法检测血浆DNA含量.方法 构建重组质粒DNA作为内参照物,采用共用下游引物的双重实时荧光定量PCR技术同步扩增人看家基因β-actin和重组质粒载体中人工合成DNA序列,定量检测健康成年人血浆DNA含量.结果 本法能在同一个反应管中对目的基因和内参照进行同步扩增,两者的扩增无相互干扰,特异性好;重组质粒DNA的平均扩增效率达90%,β-actin基因的平均扩增效率接近100%;本法批内变异系数(CV)11%,批间CV17%.结论 成功建立含有内参照的双重实时荧光定量PCR方法,可对血浆DNA进行定量检测.
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食管癌患者血浆循环DNA定量检测及临床特征分析
目的 检测食管癌患者血浆循环DNA的含量并探讨其与临床病理特征之间的关系.方法 采集44例食管癌患者及100例健康对照的外周血,用磁珠法提取DNA、双重实时荧光定量PCR检测血浆DNA含量,并用放免法检测血清CEA水平.结果 食管癌患者血浆DNA含量(中位数:54.0 ng/ml,四分位数区间:38.0～68.1 ng/ml)显著高于健康对照(中位数:18.5ng/ml,四分位区间:15.5～24.9 ng/ml),P<0.001.Ⅱa期、Ⅱb期和Ⅲ～Ⅳ期患者血浆DNA含量分别37.0(27.2～46.2)ng/ml、53.0(41.4～63.7)ng/ml和66.3(55.9～81.8)ng/ml.Ⅲ～Ⅳ期明显高于Ⅱa～Ⅱb期(P=0.003).Ⅱa和Ⅱb期组的血浆DNA含量显著高于健康对照组(P<0.001).高、中分化组和低分化组的血浆DNA含量分别为32.3(24.2～55.1)ng/ml、52.9(42.5～69.6)ng/ml和65.0(57.7～88.6)ng/ml,低分化组显著高于高、中分化组(P=0.010).以32.3 ng/mL作为临界值,血浆DNA诊断敏感性为91.2%,特异性为90.0%,ROC曲线下面积为0.959(95%CI 0.915～1.000),优于血清CEA.结论 检测血浆DNA对食管癌的筛查、早期诊断、判断肿瘤侵袭与转移具有重要价值.
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定量检测血浆DNA水平评估非小细胞肺癌患者术后复发的价值
目的 探讨定量检测非小细胞肺癌(NSCLC)患者手术前后的血浆DNA水平对术后复发的预测能力.方法 采集做肺癌根治术的40名NSCLC患者术前2-14 d(中位天数:6 d)及术后5-16 d(中位天数:8 d)的静脉血,采用含内参照双重荧光定量PCR技术,进行血浆DNA定量检测.结果 血浆DNA含量在100名健康对照者为18.5(15.5～24.9)ng/ml,在NSCLC患者术前为66.5(49.4～76.4)ng/ml,术后为56.9(43.1～89.6)ng/ml,均显著高于健康对照组(P<0.001).29例未复发患者,术后血浆DNA水平显著降低(P<0.001),11例复发患者手术前后DNA水平无显著差异(P=0.131).血浆DNA定量对NSCLC患者术后复发的诊断效能,在术前AUC=0.448,术后AUC=0.868,术后显著优于术前(P=0.002).以术后血浆DNA≥73.3 ng/ml作为临界值,预测复发的敏感性:81.8%,特异性:82.8%,阳性预测值:64.3%,阴性预测值:92.3%.结论 术后1～2周测定血浆DNA可对NSCLC患者术后复发进行评估,远早于常用的检查技术,具有重要的临床应用价值.
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血浆DNA定量用于重症肝炎患者肝细胞损伤评估
目的 定量重症肝炎患者血浆DNA的水平,与ALT比较,评估鉴别重症肝炎的临床应用价值.方法 收集30例重症肝炎患者外周血标本6 ml,以急性肝炎(20例)、慢性乙肝(90例)、肝硬化(45例)和健康体检者(100例)作为对照.用磁珠法提取血浆DNA,双重实时荧光定量PCR测定血浆DNA.结果 乙型肝炎患者的血浆DNA水平(中位数)显著高于健康对照(104.2 ng/ml vs. 23.4 ng/ml,P=0.0000).血浆DNA水平在重症肝炎患者和急性肝炎、慢性乙肝及肝硬化患者之间都具有显著性差异(P=0.0018、0.0000和0.0000).乙型肝炎患者的血清ALT水平(中位数)显著高于健康对照(107.5 U/L vs.24.1 U/L,P=0.0000).重症肝炎患者的血清ALT水平与急性肝炎之间有显著差异(P=0.0024),但与慢性乙肝和肝硬化之间没有差异(P=0.0600和1.0000).ROC曲线分析显示,在鉴别重症肝炎和肝硬化以及慢性乙肝时,血浆DNA的鉴别能力显著优于血清ALT(AUC,0.95 vs. 0.51,P=0.0000;0.86 vs. 0.34,P=0.0000).结论 用双重荧光定量PCR检测血浆DNA水平,可以作为一个用于准确鉴别重症肝炎有价值的生物学标志.
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实时荧光定量检测人血浆中RASSF1A基因启动子甲基化
目的 建立检测人血浆DNA中RASSF1A基因甲基化的方法.方法 以肺癌细胞株NCI-H460作为RAssF1A基因启动子区甲基化阳性样本,传统酚/氯仿法提取细胞DNA,经紫外分光光度计定量后以10倍稀释的浓度梯度依次投入到200 μl健康人血浆中,制备得到模拟肺癌患者血浆.用磁珠法从模拟血浆样本和15例早期肺癌患者血浆中提取总DNA.对血浆DNA模板进行亚硫酸氢盐化学修饰,并以TaqMan技术的实时荧光定量甲基化特异性PCR(MSP)进行检测.以模拟血浆样品作为标准品,用外标准曲线法对肺癌患者血浆中的甲基化RASSF1A进行定量.结果 实时荧光定量MSP对模拟肺癌患者血浆的检测低限为150拷贝(甲基化的肿瘤DNA)/ml(血浆).15例肺癌患者5例RASSF1A甲基化阳性(33.3%).5例肺癌患者血浆中甲基化的RASSF1A基因的浓度分别为2.56×103,8.20×104,1.45×104,3.31×104和4.24×104拷贝/ml.结论 实时荧光定量MSP法检测肺癌患者血浆DNA中RASSF1A基因甲基化,灵敏度高,特异性强.
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血浆中APC基因甲基化检测在早期肺癌诊断中的应用
目的 研究血浆DNA中APC基因启动子甲基化与肺部实体瘤良、恶性的关系,确定血浆中APC基因甲基化检测对早期肺癌诊断的意义.方法 以92例CT检查发现肺部实体瘤(直径≤2 cm),并在CT引导下行肺部穿刺患者和23例健康人作为研究对象,收集血浆样本,利用磁珠法提取DNA,行亚硫酸氢盐化学修饰后,采用针对APC基因启动子区的甲基化引物和探针,以荧光定量MSP法(TaqMan探针)检测APC基因的甲基化.结果 92例肺部实体瘤患者经病理诊断,有58例确诊为肺癌、31例为肺部良性疾病、3例未明确诊断.58例肺癌患者中有11例(19%)测出APC基因启动子区甲基化阳性,31例肺部良性疾病、3例未明确诊断和23例健康对照组均为阴性.结论 检测血浆DNA中APC基因启动子甲基化有助于早期肺癌的诊断.
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不同甲基化检测技术对模拟肺癌患者血浆中APC基因甲基化的检测
目的 研究模拟肺癌患者血浆DNA中APC基因甲基化低检测限,确定不同甲基化检测技术在早期肺癌诊断中的价值.方法 用普通甲基化特异性基因扩增(methylation specific PCR,MSP)方法检测肺癌细胞株NCI-H460细胞APC基因,以酚-氯仿经典方法提取NCI-H460细胞DNA,紫外分光光度计定量并以10倍稀释的浓度梯度依次投入相同的健康人血浆200μl中去,得到模拟肺癌患者血浆,利用磁珠核酸提取方法从模拟血浆样本中提取血浆DNA.对血浆DNA模板进行亚硫酸氢盐化学修饰,并以Sybr-Green Ⅰ为染料进行实时荧光定量MSP检测,同时进行普通MSP检测.结果 NCI-H460细胞中的APC基因启动子1A区719位点存在甲基化,实时荧光定量MSP检测模拟肺癌患者血浆APC基因甲基化的低检测限为在200 μl血浆中能检测出102个肿瘤细胞的DNA,而以普通MSP检测,200 μl血浆中需投入103个以上肿瘤细胞的DNA才有弱阳性条带.实时荧光定量MSP检测技术比普通MSP检测的敏感性至少高出10倍.结论 实时荧光定量MSP比普通MSP检测灵敏度高,该技术用于肺癌患者血浆DNA甲基化检测,可能有助于肺癌早期诊断.
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实时荧光定量PCR检测血浆结核分枝杆菌DNA的初步临床应用
目的 评价实时荧光定量PCR技术检测血浆(或血清)结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)DNA的技术.方法 建立实时荧光定期量PCR方法测定血浆MTB DNA,分别检测临床确诊的55例结核病患者血清43份,血浆25份以及非结核肺部疾病患者血清18份,健康体检血清18份和健康体检者血浆11份的MTB DNA含量.结果 18例非结核肺疾病患者血清、18例健康体检者血清以及11例健康体检者血浆MTB DNA全部阴性.55例初诊结核患者中10例(18.2%)治疗前血浆(或血清)MTB DNA阳性,在痰涂片阴性的18例结核患者中,血浆(或血清)MTB DNA阳性检出率为27.8%(5/18),其特异性达100%.结论 本研究证实了结核患者血浆(或血清)循环MTB DNA的存在,其定量检测对痰涂片阴性及无痰患者的结核病诊断有重要参考价值.
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血浆DNA定量检测在晚期肺癌患者个体化治疗中的应用
目的 通过监测晚期肺癌患者化疗过程中血浆DNA水平的变化,探讨其在疗效预测以及个体化治疗中的应用.方法 采集35名晚期肺癌患者化疗前、后静脉血,用磁珠法提取血浆循环DNA和内参照质粒DNA,双重荧光定量PCR技术进行DNA定量检测,以100名体检健康者为对照.结果 晚期肺癌患者化疗前血浆DNA平均含量为66.4(33.1～105.0)ng/ml,显著高于健康对照组血浆DNA平均含量22.4(16.2～30.0)ng/ml(P<0.01).一线药物化疗后,部分缓解组肺癌患者血浆DNA值较化疗前显著下降(P<0.01),且与病情稳定组、病情进展组患者血浆DNA值有显著差异(P均<0.05),而与健康对照组已无差异.生存曲线分析显示,化疗后血浆DNA<50 ng/ml的患者生存率高于血浆DNA≥50ng/ml的患者(P<0.01).结论 血浆DNA的变化可敏感地反映晚期肺癌患者化疗疗效,在肿瘤个体化治疗中发挥重要作用.
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循环游离核酸的检测及意义
游离核酸与肿瘤、妊娠相关性疾病、自身免疫病、移植排斥反应、创伤、急救医学等有着密切关系,其检测对疾病的早期诊断、分期、监测、预后判断等有重要意义.
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鼻咽癌切除术后患者血浆DNA的快速变化
目的监测鼻咽癌病人于肿瘤切除手术期间和术后,其血浆DNA浓度的变化,以了解血浆DNA在体内的动态变化情况.方法静脉抗凝血分离血浆,从血浆中提取DNA,用实时定量PCR方法分别测定手术前、后鼻咽癌病人血浆DNA的浓度.结果肿瘤手术初期,病人血浆DNA的浓度会快速升高,随后其水平会迅速下降,DNA在血浆中的半衰期为126 min;当血浆DNA水平降到低时,其水平又会再次升高,至2385 min后出现第二个峰值.结论癌症病人游离DNA可以极其迅速地从血循环中被清除,第二个峰值的水平可能对评估组织损伤严重程度具有一定的临床意义,此研究为进一步研究血浆肿瘤DNA在其他肿瘤中的变化奠定了基础.
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血浆APC和DCC基因启动子甲基化测定在肺癌早期诊断中的应用
目的:检测肺癌患者血浆游离DNA中腺瘤样结肠息肉易感基因(adenomatous polyposis coli,APC)和结直肠癌缺失基因(deleted in colorectal carcinoma,DCC)启动子甲基化状态并分析其在肺癌诊断中的意义.方法:应用甲基化特异性PCR(methylation specific PCR,MSP)法,检测70例肺癌患者、40例肺良性病变患者和30例健康志愿者血浆APC和DCC两个基因启动子区甲基化状态.同时测定血清癌胚抗原,并与血浆APC和DCC基因甲基化测定结果进行比较.结果:(1)肺癌患者血浆标本中APC、DCC基因启动子甲基化阳性检出率分别为25.71％ (18/70)、35.71％(25/70),接近于血清癌胚抗原的阳性率(37.14％);肺良性病变患者血浆中APC、DCC基因启动子甲基化阳性率分别为2.50％ (1/40)、7.50％ (3/40);健康志愿者血浆中这两个基因未检测出甲基化;3组间两基因甲基化阳性率间的差异有统计学意义(P均＜0.05);(2)APC和DCC两个基因甲基化联合检测诊断肺癌的灵敏度为51.43％,特异度为90.00％;血浆APC、DCC基因甲基化和血清癌胚抗原三项联合检测可明显提高肺癌诊断的灵敏度(68.57％),但特异度轻微下降(82.50％);(3)APC和DCC基因启动子甲基化与肺癌患者年龄、性别、吸烟指数、组织学类型、分化程度、临床分期及淋巴结转移无明显相关性(P＞0.05).结论:外周血浆中APC、DCC基因甲基化有望成为诊断肺癌的肿瘤标志物,在肺癌早期诊断中具有潜在的应用价值.
关键词： 肺癌 血浆DNA 甲基化特异性PCR 腺瘤样结肠息肉易感基因 结直肠癌缺失基因 -
肿瘤远处转移与血浆DNA水平相关性研究
目的：探讨肿瘤转移与血浆DNA水平之间的关系，评价早期诊断肿瘤转移的方法。方法：将人肺腺癌SPC-A1细胞接种到BALB/c小鼠腹腔，每周定期检测血浆DNA水平，7周后处死小鼠，观察肿瘤形成及转移情况。结果：小鼠血浆DNA水平呈升高趋势的占75.6％(34/45只)；其中接种后第3周起血浆DNA水平均比接种后第1周显著升高(P＜0.05)。血浆DNA水平升高及持续升高组小鼠中有肺转移瘤形成的占73.5％(25/34只)。无升高组小鼠中有肺转移瘤形成的占27.3％(3/11只)。血浆DNA水平升高组及持续升高组均显著高于无升高组(P＜0.05)。血浆DNA水平与肿瘤负荷正相关(R2=0.8703)。结论：形成肺转移瘤的BALB/c小鼠血浆DNA水平在早期即显著升高，血浆DNA水平可用于肿瘤转移的早期监测。
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孕妇血浆Amelogenin基因6bp差异检测对产前胎儿性别的鉴定价值
目的建立一种可靠性强的非创伤性鉴别胎儿性别的方法.方法根据Amelogenin基因第3内含子在X-Y染色体上6bp的差异,采用PCR技术扩增孕妇血浆游离DNA,运用聚丙烯酰胺凝胶电泳、溴化乙锭染色鉴定其基因型,从而判断胎儿性别.结果32例孕妇血浆DNA标本中,19例被诊断为男性,13例被诊断为女性,所得结果与产后胎儿实际性别相比较,符合率为96.88%.结论通过检测孕妇血浆DNA Amelogenin基因6bp差异产前诊断胎儿性别方法可行,结果可靠.
关键词： 性别鉴定 Amelogenin基因 产前诊断 血浆DNA -
血浆 DNA 定量检测在慢性白血病患者疗效评估中的临床应用
目的：白血病患者外周血中循环DNA的异常增高早于骨髓检查，血浆循环DNA可代替骨髓细胞用于白血病的辅助诊断。文中旨在定量检测慢性白血病患者血浆DNA水平，探讨血浆DNA水平在慢性白血病化疗疗效评判中的临床应用价值。方法收集2008年5月至2014年8月南京医科大学第一附属医院和南京市江宁医院血液科住院患者慢性粒细胞白血病（ chronic myelogenous leukemia， CML）患者52例（包括慢性期33例、加速期7例、急变期12例）、慢性淋巴细胞白血病（ chronic lymphocytic leukemia， CLL）患者85例[包括完全缓解（ complete remission， CR）者28例、部分缓解（ partial remission， PR）者27例、未缓解（ non-remission， NR）者30例]和多毛细胞白血病（ hairy cell leukemia， HCL）患者4例。同期选择80例体检健康者作为对照组。用磁珠法对患者血浆DNA和重组质粒DNA同步提取，再对人β-actin基因和内参照质粒DNA进行双重荧光定量PCR测定。结果①化疗前血浆DNA水平CML患者[149．46（30．63～496．91）ng／mL]、CLL患者[101．54（69．10～258．14）ng／mL]均显著高于对照组[19．05（12．67～25．92）ng／mL ]，差异有统计学意义（P＜0．001）。②CML患者化疗后血浆DNA水平显著低于化疗前水平，但仍显著高于对照组（P＜0．001）。③CML慢性期患者血浆DNA水平[302．89（93．33～541．52）ng／mL]显著高于急变期患者[43．19（23．54～70．03）ng／mL]及加速期患者[28．11（16．21～92．07）ng／mL]，差异有统计学意义（P＜0．05）。④CR组血浆DNA含量[24．29（14．64～30．74）ng／mL]显著低于PR组[106．88（96．23～143．25）ng／mL]和NR 组[460．73（284．57～653．38）ng／mL]，差异有统计学意义（P＜00．01）；PR组、NR组血浆DNA含量显著高于对照组（ P＜0．001）。结论血浆DNA定量检测在对慢性白血病患者的化疗疗效评估中具有临床应用价值。
