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酵母双杂交筛选白细胞中新基因NS3TP6结合蛋白基因
目的:用酵母双杂交技术筛选白细胞中与丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白3(NS3)反式调节靶基因编码产物NS3TP6蛋白结合蛋白的基因.方法:用多聚酶链反应(PCR)法扩增HCV NS3TP6蛋白基因,连接入酵母表达载体pGBKT-7中构建诱饵质粒,转化酵母细胞AHl09并在其内表达,然后与转化了人白细胞文库质粒的酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基上进行双重筛选阳性菌落,增菌后提取质粒,转化入大肠杆菌,提取质粒并测序,进行生物信息学分析.结果:成功克隆出HCV NS3TP6蛋白基因并在酵母细胞中表达,配合后选出在四缺(SD/-Trp-Leu-Ade-His)培养基和铺有X-α-半乳糖(X-α-gal)的四缺培养基上均能生长并变成蓝色的真阳性菌落共7个,其中3个人类白细胞CDl4抗原,1个人类免疫球蛋白入轻链,3个人类推定蛋白基因(ACl24014,AC097504,AC023785).结论:成功克隆出NS3TP6蛋白的结合蛋白,为进一步研究HCV的作用提供了新线索.
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丙型肝炎病毒核心蛋白与载脂蛋白A1结合的研究
目的:为了探讨丙型肝炎病毒(HCV)核心(core)蛋白在肝脂肪变性中起作用的分子机制,研究了核心蛋白是否与脂肪代谢相关蛋白存在相互作用.方法:应用酵母双杂交系统3,构建HCV核心蛋白诱饵质粒,转化酵母AHl09后与含文库质粒的酵母Y187进行配合,在营养缺陷培养基上进行双杂交筛选.筛选出30个克隆,对能在涂有X-α-gal的四缺营养缺陷培养基(SD/-Trp-Leu-His-Ade)上生长并变蓝的菌落,提取酵母克隆的质粒转化大肠杆菌后测序,进行生物信息学分析.结果:发现了一个与载脂蛋白Al(apoAl)同源序列,同源性99%.结论:载脂蛋白Al在酵母双杂交中能与HCV核心蛋白相互作用,推测此蛋白参与了脂质代谢紊乱,部分解释了HCV感染后普遍引起肝脂肪变性的发病机制.
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抑制性消减杂交筛选疾病相关基因的研究进展
随着人类基因组测序的完成,疾病相关基因的鉴定和克隆将会变得更加快捷和方便.一旦疾病基因的功能被揭示,将会对疾病发病机制产生新的认识.由于基因表达在疾病发展的不同阶段呈现出差异性,这就为我们寻找、鉴定和克隆致病基因提供了一个重要线索.抑制性消减杂交(SSH)就是近年来发展起来的一种有效的分离差异表达基因的方法.
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存活素与泌尿系肿瘤研究进展
细胞凋亡抑制与恶性肿瘤的发生发展以及放、化疗不敏感有密切关系.存活素(survivin)是1997年由Ambrosini等[1]用效应细胞蛋白酶受体-1(EPR-1)cDNA在人类基因库的杂交筛选中分离出来的凋亡抑制蛋白(IAP)家族新成员.近年来对存活素的结构、功能及其与肿瘤的发生发展研究较多,已取得一定进展,现对其研究现状及与泌尿系肿瘤的关系综述如下.
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Survivin研究进展与原发性支气管肺癌
1997年耶鲁大学的Altieri用效应细胞蛋白酶受体-1(effector cell protease receptor-1,EPR-1)在人类基因组库的杂交筛选中发现了一个新的基因,命名为Survivin,其编码的蛋白称之为survivin蛋白,根据其结构和功能,survivin蛋白是IAPs家族的新成员.
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生存素与非小细胞肺癌
生存素(survivin)是凋亡抑制蛋白(IAP)家族的新成员,是近年来发现的该蛋白家族8个成员(即XIAP、HIAP1、HIAP2、NAIP、survivin、Livin、Ts2IAP和Apol2lon)之一[1].1997年survivin由Aatien等利用效应细胞蛋白酶受体21(EPR21)cDNA在人类基因组库的杂交筛选中首先分离出来,是迄今发现的强凋亡抑制因子,其与细胞周期调控和细胞凋亡密切相关[2].
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Survivin反义寡核苷酸对bcl-2、bax表达的影响
人Survivin 基因是经效应细胞蛋白酶受体(EPR-1)cDNA在人类基因组库的杂交筛选中分离出来的,因其具有抑制细胞凋亡和调节细胞有丝分裂的双重生物学特性受到关注[1,2].我们以Survivin SAO转染C6胶质瘤细胞,进一步观察对其bcl-2和bax 的影响及其相关性.
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大肠癌Survivin基因研究进展
大肠癌(cdorectal cancer,CRC)是我国位居第五位的常见恶性肿瘤,其发病率和死亡率都有逐年增高的趋势,发病年龄也明显提高.大肠癌的发生发展是一个涉及多种基因改变和多阶段的致癌复杂过程.Survivin是凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein,IAP)家族中的一个成员,人类Survivin基因是Ambrosini等于1997年经效应细胞蛋白酶受体1(effector cell prctease receptor-1,EPR-1)cDNA在人类基因组库的杂交筛选中分离出来的[1].
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Survivin与肿瘤治疗的研究进展
rvivin是1997年Ambrosini等用效应细胞蛋白酶受体-1(EPR-1)cDNA在人类基因库的杂交筛选中分离得到[1],是凋亡蛋白抑制因子(inhibitors of apoptosis protein,IAP)家族中具有基础与临床研究意义而备受关注的分子.本文就survivin在肿瘤治疗方面的研究综述如下.
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Survivin与泌尿系肿瘤研究进展
细胞凋亡是由细胞内特定基因的程序性表达而介导的细胞死亡,它一方面是生物个体胚胎发育过程中的程序性事件,另一方面是成熟个体在各种生理病理条件下维持组织中细胞数目平衡的反应.细胞凋亡抑制与肿瘤的发生发展及对放、化疗不敏感密切相关.存活素(Survivin)是1997年由Ambrosini等[1]用效应细胞蛋白酶受体-1(EPR-1)cDNA在人类基因库的杂交筛选中分离出来的凋亡抑制蛋白(IAP)家族新成员.现对其研究现状及与泌尿系肿瘤的关系综述如下.
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Survivin基因大肠癌
大肠癌(colorectal cancer,CRC)是我国位居第五的常见恶性肿瘤,其发病率和死亡率都有逐年增高的趋势,发病年龄也明显提高.(CRC)的发生发展是一个涉及多种基因改变和多阶段的致癌复杂过程.Survivin是凋亡抑制蛋白(inhibitor of apop-tosis protein,IAP)家族中的一个成员,人类Survivin基因是Am-brosini等于1997年经效应细胞蛋白酶受体1(effector cellpretease receptor-1,EPR-1)cDNA在人类基因组库的杂交筛选中分离出来的.近年来大量的研究表明CRC中Survivin的阳性表达与CRC的发生、转移均有一定关系[1-3].就Survivin基因的结构、分布、作用及其在CRC发生过程中的作用综述如下.
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用定量PCR从杂交阳性融合噬菌斑中分离候选插入片段
目的 为了在cDNA文库杂交筛选目的基因过程中,当复筛的杂交信号对应于1个多克隆融合噬菌斑时,能够快速、准确地分离出特异克隆的插入片段.方法 依据定量PCR扩增的原理,利用初始模板量的不同,通过两次PCR反应,鉴定和分离出所需cDNA片段.结果 利用这一方法,在β-1,4-半乳糖苷转移酶cDNA的"步移"复筛中,从一个双克隆融合斑中,得到了特异性克隆的插入片段,经测序证实为β-1,4-半乳糖苷转移酶的5′cDNA序列,长1.9kb,从而完成了全长cDNA的克隆,节省了进行再次复筛的时间和材料.结论 该方法简便、快捷,可以显著地节省时间和实验材料,在新基因克隆中有一定的实用价值.
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Survivin基因的表达及意义
Survivin是凋亡抑制因子家族中的重要成员,在调节细胞分裂、细胞应激反应、细胞周期检查点、组织模式、细胞因子激活和不同的细胞信号通路的激活中起关键作用[1],具有不同于家族其他成员的独特性质和结构,被认为是迄今发现的强的凋亡抑制因子.1997年耶鲁大学的Ambrosini等利用效应细胞蛋白酶受体cDNA在人类基因组库的杂交筛选中克隆出Survivin,其基因定位于17Q25[2],编码142个氨基酸,分子量为16.3 KD,含有4个外显子和3个内含子.Survivin通过多种途径促进肿瘤形成与进展:(1)Survivin可竞争CDK4,因Survivin对CDK4的竞争力强于pl6,导致CDK4被活化,进而使细胞从G1期向S转化,终造成细胞的无限制生长;(2)Survivin可增加血管生成素I的表达,从而促进毛细血管网的形成和内皮细胞的增生;(3)Survivin还可以表达于G2/M期,以周期调节方式和对纺锤体微管作用,促使细胞异常有丝分裂,以克服凋亡;(4)Survivin抑制线粒体细胞色素C的释放以达到直接或间接抑制凋亡下游效应分子Caspase-3和Caspase-7,终促进肿瘤进展[3].