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酵母双杂交技术筛选HCV E1蛋白结合的肝细胞蛋白基因
目的:用酵母双杂交技术筛选肝细胞中与HCV E1蛋白结合蛋白的编码基因.方法:用多聚酶链反应(PCR)法扩增HCV E1基因,连接入酵母表达载体pGBKT7中构建诱饵质粒,转化酵母细胞AH109并在其内表达,然后与转化了人肝cDNA文库质粒pACT2的酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基和X-α-半乳糖(X-α-gal)上进行双重筛选阳性菌落,增菌后提出质粒,转化入大肠杆菌(DH5α),提出质粒并测序,进行生物信息学分析.结果:获得了19个与E1蛋白特异性结合的阳性克隆,其中16个克隆为已知蛋白基因和3个克隆为未知功能蛋白基因.结论:成功克隆出与丙型肝炎病毒E1蛋白结合的肝细胞蛋白,为进一步研究HCV E1在HCV致病中的作用提供了新线索.
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酵母双杂交技术筛选白细胞中乙型肝炎病毒核心蛋白结合蛋白基因
目的:用酵母双杂交技术筛选白细胞中与乙型肝炎病毒(HBV)核心蛋白结合蛋白的基因.方法:用多聚酶链反应(PCR)法扩增HBV核心蛋白编码基因,连接入酵母表达载体pGBKT-7中构建诱饵质粒,转化酵母细胞AH109并在其内表达,然后与转化了人白细胞文库质粒的酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基上进行双重筛选阳性菌落,增菌后提出质粒,转化入大肠杆菌(DH5α),提出质粒并测序,进行生物信息学分析.结果:成功克隆出HBV核心蛋白编码基因并在酵母细胞中表达,配合后选出既能在四缺(SD/-Trp-Leu-Ade-His)培养基又能在铺有X-α-半乳糖(X-α-gal)的四缺培养基上均能生长并变成蓝色的真阳性菌落17个,其中肿瘤高甲基化1基因3个,编码线粒体蛋白的DNA聚合酶γ基因1个,乙酰辅酶A合成酶3基因1个,假定翻译起始因子基因1个,趋化因子受体5基因1个,线粒体核糖体蛋白L41基因1个,Kyot结合蛋白基因1个,Ran结合蛋白基因1个,真核细胞翻译延伸因子2基因2个,未知基因5个.结论:成功克隆出乙型肝炎病毒核心蛋白的结合蛋白,为进一步研究HBV核心蛋白在病毒装配、损害肝细胞、感染致病等方面的具体作用提供了新线索.
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应用酵母双杂交技术筛选肝细胞cDNA文库中乙型肝炎病毒前-X蛋白结合蛋白基因
目的:用酵母双杂交技术筛选肝细胞中与乙型肝炎病毒(HBV)前-X蛋白结合蛋白的编码基因.方法:用多聚酶链反应(PCR)法扩增HBV基因组中的前-X基因,连接入酵母表达载体pGBKT-7中构建诱饵质粒,转化酵母细胞AH109并在其内表达,然后与转化了人肝细胞文库质粒的酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基上进行双重筛选阳性菌落,增菌后提出质粒,转化入大肠杆菌(DH5α),提出质粒并测序,进行生物信息学分析.结果:成功克隆出HBV的前-X基因,构建表达载体并在酵母细胞中表达,配合后选出在四重缺陷(SD/-Trp-Leu-Ade-His)培养基及铺有X-α-半乳糖(X-α-gal)的四重缺陷培养基上均能生长并变成蓝色的真阳性菌落19个,其中5个是人铁蛋白;1个是人的胰岛素样生长因子结合蛋白3(IGFBP3);1个是人醛缩酶B;1个是人糖基化磷脂酰肌醇锚定结合因子1(GPAAl);1个是人血红素结合蛋白;1个是人C1酯酶抑制子(C1-INH);1个是人玻连蛋白;1个是人电压依赖性阴离子通道1(VDACl);1个是丝氨酸穿膜蛋白酶(hepsin);1个是人梭素;1个是人纤溶酶原(PLG);3个是人假想蛋白;1个是RP11-542M13克隆,位于染色体16.结论:成功克隆出前-X的结合蛋白,为进一步研究HBV的前-X蛋白的作用提供了新线索.
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应用酵母双杂交技术筛选白细胞cDNA文库与NS5ATP1结合蛋白基因
目的:用酵母双杂交技术筛选白细胞中与NSA5TP1结合蛋白的编码基因.方法:用多聚酶链反应(PCR)法扩增NS5ATP1基因,连接入酵母表达载体pGBKT-7中构建诱饵质粒,转化酵母细胞AH109并在其内表达,然后与转化了人白细胞文库质粒的酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基上进行双重筛选阳性菌落,增菌后提出质粒,转化入大肠杆菌(DH5α),提出质粒并测序,进行生物信息学分析.结果:成功克隆出NS5ATP1基因并在酵母细胞中表达,配合后选出在四缺(SD/-Trp-Leu-Ade-His)培养基及铺有X-α-半乳(X-α-gal)的四缺培养基上均能生长并变成蓝色的真阳性菌落10个,其中2个人HLA-B27;2个人亚砷酸盐转移子(arsA);1个人单倍型E22i线粒体;1个人pyrin(MEFV);1个人肌动蛋白素1(cofilin 1);1个人染色体15;1个来自RP11-353N14克隆人的DNA基因,位于染色体17;1个新基因.结论:成功克隆出NS5ATP1的结合蛋白,为进一步研究HCV的作用提供了新线索.
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酵母双杂交技术筛选白细胞中HCV NS3蛋白结合蛋白基因
目的:用酵母双杂交技术筛选白细胞中与丙型肝炎病毒(HCV)NS3蛋白结合蛋白的编码基因.方法:用多聚酶链反应(PCR)法扩增NS3基因,连接入酵母表达载体pGBKT-7中构建诱饵质粒,转化酵母细胞AH109并在其内表达,然后与转化了人白细胞文库质粒的酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基上进行双重筛选阳性菌落,增菌后提出质粒,转化入大肠杆菌(DH5α),提取质粒并测序,进行生物信息学分析.结果:成功克隆出NS3基因并在酵母细胞中表达,配合后选出在四缺(SD/-Trp-Leu-Ade-His)培养基和在铺有X-α-半乳糖(X-α-gal)的四缺培养基上均能生长并变成蓝色的真阳性菌落18个,其中4个真核细胞翻译延伸因子2;2个免疫球蛋白λ轻链;1个肌动蛋白β;1个铁蛋白轻多肽;1个(丝裂原)活化蛋白激酶3;2个肌球蛋白因子1;1个白介素2受体β;1个富含精氨酸/丝氨酸剪切因子6;1个组织蛋白酶S;1个2'-5'寡腺甘酸合成酶类似物;1个缺失精子缺乏相关蛋白2;1个CNN2;1个新基因.结论:成功克隆出HCV NS3的结合蛋白,为进一步研究HCV的作用提供了新线索.
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酵母双杂交技术筛选白细胞中HCV核心蛋白结合蛋白基因
目的:用酵母双杂交技术筛选白细胞中与丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白结合蛋白的基因.方法:用多聚酶链反应(PCR)法扩增HCV核心蛋白基因,连接入酵母表达载体pGBKT-7中构建诱饵质粒,转化酵母细胞AH109并在其内表达,然后与转化了人白细胞文库质粒的酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基上进行双重筛选阳性菌落,增菌后提取质粒,转化入大肠杆菌,提取质粒并测序,进行生物信息学分析.结果:成功克隆出核心蛋白基因并在酵母细胞中表达,配合后选出在四缺(SD/-Trp-Leu-Ade-His)培养基和铺有X-α--半乳糖(X-α-gal)的四缺培养基上均能生长并变成蓝色的真阳性菌落共6个,其中2个高尔基复合体关联蛋白1,1个Ran结合蛋白M,1个pellino同族体2,2个未知功能蛋白基因(KIAA1949).结论:成功克隆出丙型肝炎病毒核心蛋白的结合蛋白,为进一步研究HCV的作用提供了新线索.
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淋巴细胞内与乙型肝炎病毒X蛋白结合的新蛋白X-30编码基因的克隆
目的:为探讨HBxAg在HBV致病过程中的作用,筛选并克隆人淋巴细胞cDNA文库中与HBxAg有相互作用的蛋白基因.方法:利用酵母双杂交系统3筛选并克隆人淋巴细胞cDNA文库中与HBxAg有相互作用的蛋白的基因.将HBxAg编码基因连接入酵母表达载体pGBKT7中构建诱饵质粒,转化酵母细胞AH109并在其内表达,然后与转化了人淋巴cDNA文库质粒pACT2的酵母细胞Y187进行配合,双重筛选阳性菌落,提取质粒并测序,结果进行生物信息学分析,发现其中有1个未知基因.根据GenBank中的序列信息设计引物,从HepG2细胞提取总RNA,以逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术扩增获得该新基因的全长序列,并测序证实,命名为X-30,在GenBank中注册,注册号为AY280722.结果:X-30基因的编码序列全长为315个核苷酸(nt),编码产物由103个氨基酸残基(aa)组成.结论:HBxAg与淋巴细胞结合蛋白新型基因X-30的筛选与克隆,为进一步研究HBxAg的分子生物学机制及探索新型治疗技术奠定了基础.
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应用白细胞cDNA文库的酵母双杂交技术筛选HCTP4结合蛋白基因
目的:用酵母双杂交技术筛选白细胞中与HCTP4蛋白结合的蛋白的编码基因.方法:用多聚酶链反应(PCR)法扩增HCTP4基因,连接入酵母表达载体pGBKT-7中构建诱饵质粒,转化酵母细胞AH109并在其内表达,然后与转化了人白细胞文库质粒的酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基上进行双重筛选阳性菌落,增菌后提出质粒,转化入大肠杆菌(DH5α),提出质粒并测序,进行生物信息学分析.结果:成功克隆出HCTP4基因并在酵母细胞中表达,配合后选出在四缺(SD/-Trp-Leu-Ade-His)培养基及铺有X-α-半乳糖(X-α-ga1)的四重缺陷培养基上均能生长并变成蓝色的真阳性菌落44个,其中25个免疫球蛋白λ轻链;6个来自RP11-189K21克隆的人DNA序列;4个来自RP11-507C10克隆的人DNA序列;2个人BAC克隆RPCI11-75L1;1个人BAC克隆RP11-21M10;1个人遍素酶智能弹(MIB);1个来自RP11-867O8克隆的人DNA基因;1个来自RP3-509I19克隆的人DNA序列;1个小核糖核蛋白G;1个UMP-CMP激酶;1个新基因.结论:成功克隆出HCTP4的结合蛋白,为进一步研究丙型肝炎病毒(HCV)的作用提供了新线索.
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乙型肝炎病毒前-S2蛋白结合蛋白基因S2-29的克隆化研究
目的:筛选人肝细胞中与乙型肝炎病毒(HBV)前-S2蛋白(Pre-S2)相互作用的蛋白,探寻HBV致病机制.方法:用多聚酶链反应(PCR)技术扩增HBV前-S2基因,连接入酵母表达载体pGBKT7中构建诱饵质粒,转化酵母细胞AHl09并在其内表达,然后与转化了人肝cDNA文库质粒的酵母细胞Y187进行配合,用营养缺陷型培养基及蓝白斑双重筛选阳性菌落,提取酵母质粒转化大肠杆菌并测序,进行生物信息学分析.逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)方法从HepG2细胞的mRNA中扩增出完整的新基因S2-29,连入另一酵母表达载体pGADT7,并用免疫共沉淀方法再次证实二者间的相互作用.结果:成功克隆出HBV前-S2基因并在酵母细胞中表达,配合后筛选出既能在四缺(SD/-Trp-Leu-His-Ade)培养基又能在铺有X-α-半乳糖(X-α-gal)的四缺培养基上生长并变成蓝色的真阳性菌落26个,其中有1个未知基因S2-29,该基因能在HepG2细胞中表达,免疫共沉淀方法证实二者在体外也有结合作用.结论:成功克隆出与乙型肝炎病毒前-S2蛋白相结合的新基因,为进一步研究HBV前-S2的作用提供了新线索.