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A型核纤层蛋白的C端相互作用蛋白的筛选及鉴定
目的:筛选A型核纤层蛋白(lamin A)相互作用蛋白,探讨lamin A造成细胞早老的机理.方法:以lamin A的C末端区域为诱饵蛋白,采用酵母双杂交方法从人骨骼肌cDNA文库中筛选lamin A相互作用蛋白.并采用GST-Pull down实验和western blotting进行鉴定.结果:筛选得到包括MT-2A在内的14个候选相互作用蛋白.MT-2A与lamin A能相互作用.结论:MT-2A在细胞外与lamin A相互作用.
关键词： 酵母双杂交 A型核纤层蛋白 衰老 GST-pull down -
HSPC238相互作用蛋白RPL5的初步筛选
目的：构建HSPC238诱饵载体，筛选与HSPC238相互作用的目标蛋白。方法：基因合成法合成HSPC238基因，sfiIA和sfiIB双酶切后与pGBKT7诱饵载体连接，获得诱饵质粒pGBKT7-HSPC238，经测序鉴定后与酵母双杂交空质粒pGBKT7共同转化到酵母菌株AH109，在营养缺陷培养基中观察pGBKT7-HSPC238的自激活作用，进一步从人胎肝cDNA文库中筛选与HSPC238相互作用的目标蛋白。结果：诱饵载体pGBKT7-HSPC238构建成功，经表型筛选检测无自激活作用，经酵母双杂交技术结合文献分析，从人胎肝cDNA文库中初步筛选发现核糖体蛋白L5（Ribosomal protein L5，RPL5）可能是HSPC238相互作用的目标蛋白之一。结论：成功构建pGBKT7-HSPC238诱饵质粒载体，且经酵母双杂交技术结合文献分析发现RPL5可能是与HSPC238相互作用的目标蛋白之一。
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衰老相关蛋白prelamin A与MT-2A的相互作用
目的 分析衰老相关蛋白prelamin A是否与MT-2A相互作用,以及MT-2A与衰老的关系.方法 采用酵母双杂交方法从人骨骼肌文库中筛选prelamin A的相互作用蛋白,酵母一对一回复性杂交和荧光共定位验证MT-2A与prelamin A是否相互作用.RT-PCR分析MT-2A在正常和早老细胞中的表达.结果 通过酵母双杂交方法从人骨骼肌文库中筛选到prelamin A的候选相互作用蛋白MT-2A,一对一回复性验证也证明两者能在酵母细胞中相互作用.构建含绿色荧光蛋白的MT-2A融合表达载体转染HEK-293细胞,激光共聚焦显微观察发现MT-2A能与带红色荧光蛋白的prelamin A蛋白在核膜共定位.研究还发现MT-2A的表达在早老细胞中显著下调(P＜0.01).结论 MT-2A作为一个新的prelamin A结合蛋白,可能在细胞早老过程中具有重要的作用.
关键词： MT-2A prelamin A 相互作用 酵母双杂交 衰老 -
人卵巢 cDNA 文库中与蛋白激酶 Wee1B 相互作用的候选分子的筛选及其调控作用
目的：利用酵母双杂交系统筛选与蛋白激酶 Wee1B 相互作用的新候选分子，并用生物信息学方法分析其与 Wee1B 相互作用是否能调控小鼠受精卵早期发育。方法：以 pcDNA3.1／V5 His TOPO Wee1B WT 质粒为模板构建 pGBKT7 Wee1B 诱饵质粒；制备酵母感受态细胞，将诱饵质粒 pGBKT7 Wee1B 转化酵母感受态细胞后分别接种 SD／Trp （SDO）、SD／Trp／XαGal （SDO／X）和 SD／Trp／XαGal／AbA plates （SDO／X／A）培养板检测其对酵母的毒性和自身激活能力，利用 Western blotting 法检测 pGBKT7 Wee1B 在酵母中的表达情况；将含有 pGBKT7 Wee1B 的酵母感受态细胞与人卵巢 cDNA 文库相融合，利用酵母双杂交系统筛选出阳性克隆，提取阳性克隆的酵母质粒转化大肠杆菌后进行测序鉴定，终再经酵母重新转化验证。在 GenBank 中对其进行BLAST 分析，根据基因注释推断其在小鼠受精卵发育过程中可能发挥的作用。结果：双酶切鉴定和测序分析， pGBKT7 Wee1B 诱饵质粒构建成功。将该质粒转入酵母感受态细胞后在 SDO／X／A 平皿上无克隆。将 pGBKT7 Wee1B 和 pGBKT7空载体转入酵母感受态细胞中，菌液接种于 SDO 平皿，2个 SDO 平皿上克隆都均匀生长。从工作板 SDO 和阳性对照板上挑取阳性克隆扩大培养，裂解细胞提取蛋白，Western blotting 法检测示 pGBKT7 Wee1B 对应位置出现条带。含诱饵质粒的酵母菌与人卵巢 cDNA 文库融合，PCR 验证融合后的阳性克隆质粒有插入片段。将质粒测序并经 BLAST 分析筛选出9个与 Wee1B 蛋白激酶存在相互作用的蛋白，生物信息学分析可能与小鼠卵母细胞发育和受精卵发育密切相关的蛋白。结论：利用酵母双杂交系统从人卵巢 cDNA 文库中筛选出9个与 Wee1B 蛋白激酶相互作用的蛋白，这些筛选蛋白可能通过与 Wee1B 相互作用调控小鼠卵母细胞成熟和受精卵早期发育。
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白血病细胞分化基因C-myc、HOX(A9)蛋白的相互作用
目的 通过酵母双杂交方法研究C-myc和同源盒HOX(A9)蛋白质之间的相互作用.方法 运用反转录PCR法提取白血病全血细胞总RNA,以cDNA为模板合成目的基因,同时构建重组表达载体pGADT7-C-myc、pGBKT7-HOX(A9),运用酵母双杂交方法研究C-myc和HOX(A9)蛋白质之间的相互作用.结果 成功构建了重组表达载体pGADT7-C-myc和pGBKT7-HOX(A9),经酵母双杂交方法检测,二者间没有相互作用.结论 C-myc和同源盒HOX(A9)蛋白之间不存在相互作用.
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分离的泛素系统--一种新型的膜蛋白酵母双杂交系统
酵母双杂交系统是研究蛋白质间相互作用的重要遗传学方法之一,然而传统的酵母双杂交技术在实际应用中存在着一定的局限性.分离的泛素系统(split-ubiquitin system)作为一种新型的不依赖转录激活机制的酵母双杂交系统,原理是通过待检测蛋白质之间的相互作用将突变的、分离的泛素分子N端和C端部分融合,通过泛素专一的蛋白酶UBP的识别使报告蛋白解离入核,激活报告基因表达.该系统被研究的蛋白质间的相互作用不在局限于核内,更适合于发生在胞膜或胞质中的相互作用研究,是一种非常值得推广的遗传学方法.
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ORP8与SPAG5相互作用并影响细胞周期
目的:筛选与氧化固醇结合蛋白相关蛋白8(Oyxterol binding protein related protein 8,ORP8)相互作用的蛋白质,为揭示ORP8在细胞中的功能及其机制提供线索,并根据相互作用蛋白质初步探索ORP8的功能.方法:构建重组诱饵质粒Pgbkt7-ORP8m,利用GAL4酵母双杂交系统筛选人Universal Cdna文库,筛选出与ORP8相互作用的蛋白质,通过GST Pull-down以及免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,Co-IP)验证蛋白质相互作用,并通过流式细胞仪检测过表达ORP8对HepG2细胞周期的影响.结果:酵母双杂交筛选得到了精子相关抗原5(Homo sapiens sperm associated antigen 5,SPAG5),体外GST pull-down和Co-IP实验确证了ORP8-SPAG5的相互作用,流式细胞术显示ORP8过表达后与空载体相比,人肝癌细胞系HepG2的S期细胞数增加,G1期细胞数减少.结论:SPAG5是与ORP8相互作用的蛋白质,ORP8过表达影响人肝癌细胞系HepG2的细胞周期,可能通过SPAG5起作用.ORP8-SPAG5的相互作用为进一步研究ORP8在肝细胞中的功能及其机制提供了有用的线索
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LAMR1与PER1蛋白作用位点的筛选
目的:筛选出与PER1蛋白相互作用的LAMR1的核心位点.方法:采用盒式定点突变法,对重组目的质粒pGADT7-Rec/Lamr1201-295的插入片段Lamr1201-295羧基末端的205-216氨基酸序列RDPEEIEKEEQA进行定点突变,并以hPER1蛋白的bHLH-PAS结构域为诱饵蛋白,通过酵母双杂交系统确定这4种不同的突变LAMR 1201-295片段与hPER1的相互作用.结果:营养缺陷培养基筛选显示4种转化菌在二缺SD/-Leu/-Trp、三缺SD/-His/-Leu/-Trp和四缺SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp固体培养基上都可以生长；β-半乳糖苷酶印膜法检测结果显示4种转化菌均可显色.结论:突变片段LAMR1-RDP,LAMR1-EEI,LAMR1-EKE和LAMR1-EQA都能够与hPER1的bHLH-PAS结构域在酵母中发生相互作用.提示LAMR1的205-216Aa可能不是其与hPER1相互作用的核心氨基酸序列.
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候选蛋白多聚胞嘧啶结合蛋白1与泛素连接酶环指蛋白4交互作用的研究
目的:寻找与类泛素(small ubiquitin-like modifier,SUMO)介导的泛素连接酶(SUMO-targeted ubiquitin ligase,STUbL)环指蛋白(ring finger protein 4,RNF4)相互作用的蛋白以及底物,为相关疾病的分子靶向治疗提供理论依据和实验数据.方法:采用酵母双杂交技术在人脑互补DNA文库、高灵敏质谱分析技术在RNF4过表达细胞系中筛选出一批与RNF4相互作用的候选蛋白.通过免疫共沉淀(CO-IP)实验验证候选蛋白是否确实与RNF4发生相互作用,采用相同实验检测候选蛋白是否可被SUMO化修饰.结果:酵母双杂交和高灵敏质谱分析技术筛选出77个候选蛋白.验证了采用2种方法均筛出的多聚胞嘧啶结合蛋白1[poly(rC) binding protein 1,PCBP1]可与RNF4交互作用,并且CO-IP实验证实PCBP1可以与SUMO相互作用.结论:PCBP1与RNF4存在交互作用,PCBP1蛋白可以被SUMO化修饰,RNF4可能通过调控SUMO化的PCBP1的降解来影响其功能.
关键词： 环指蛋白4 多聚胞嘧啶结合蛋白1 类泛素 酵母双杂交 质谱分析 -
应用酵母双杂交技术筛选与癌性锚蛋白重复序列相互作用的蛋白
目的:筛选与癌性锚蛋白重复序列(Gankyrin)相互作用的蛋白.方法:构建诱饵(Bait)质粒pGB-Psmd10-1,采用β-半乳糖苷酶滤膜分析检测其自身转录活性,以Bait质粒筛选人Hela细胞MATCHMAKER cDNA文库,共转染重复验证阳性克隆,并测序鉴定.结果:成功构建Bait质粒,经验证对报告基因LacZ无自激活作用.以Bait质粒筛选人Hela细胞cDNA文库,获得83个克隆,其中5个克隆经重复验证确定为阳性克隆,测序结果显示其cDNA为Psmc4的3段不同剪接体(NM_006503.2,NM_153001.1).结论:在人Hela细胞中,Psmc4为与Gankyrin相互作用的蛋白.
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酵母双杂交筛选与弓形虫毒力因子ROP18相互作用的宿主蛋白
目的 利用酵母双杂交方法,筛选与弓形虫毒力因子ROP18相互作用的宿主蛋白. 方法 RT-PCR扩增弓形虫RH株速殖子ROP18基因片段,扩增产物经双酶切后插入酵母双杂交诱饵载体pGBKT7中,将重组质粒导入酵母AH109菌株中,检测诱饵载体有无毒性和自激活作用,利用酵母双杂交系统从人胚胎脑cDNA文库中筛选与ROP18相互作用的宿主蛋白. 结果 构建了诱饵载体pGBKT7-ROP18,ROP18具有自激活功能.用ROP1825-251aa为诱饵,筛选获得一系列与ROP18相互作用的宿主蛋白:DNA损伤特异性结合蛋白1(DDB1)、torsin A相互作用蛋白1(TOR1AIP1)、整联蛋白β31 (integrinβ1)、溶质运载蛋白3(SLC3A2)、酪氨酸硫化转移酶2(TPST2)、Derl样域家族成员2 (DERL2)和OCIA结构域蛋白1(OCIAD1). 结论 通过酵母双杂交技术筛选出与弓形虫毒力因子ROP18相互作用的多种宿主蛋白.
关键词： 弓形虫 ROP1825-251aa 酵母双杂交 相互作用 宿主蛋白 -
酵母双杂交技术筛查与vasostatin相互作用的蛋白质
目的:通过酵母双杂交技术筛查与血管生长抑制因子vasostatin相互作用的蛋白质,为进一步阐明其抑制血管生成作用的分子机制奠定基础.方法:应用第3代酵母双杂交系统,构建vasostatin诱饵质粒,经过表达和自激活验证后筛选预转化的人内皮细胞cDNA文库.将在四缺培养基中筛选得到的阳性克隆提取酵母质粒转化大肠杆菌,进行限制性酶切和测序,寻找可能与vastotatin具有相互作用的蛋白序列.结果:经过酵母双杂交共获得21个克隆,经过验证,有3个阳性克隆;经过NCBI的BLAST进行同源性分析,它们的核酸和蛋白序列与已知基因高度同源,它们分别为层黏连蛋白α5(7 547～8 112)和整合素αV(1 257～1 820、316～878)片段,均为重要的配体结合部位.Vasostatin蛋白通过与该区域结合,影响FAK、VEGF和bFGF等的信号通路,抑制血管生成.结论:酵母双杂交筛选获得的层黏连蛋白和整合素蛋白的3个蛋白片段,它们与肿瘤内血管内皮细胞增殖和迁移等密切相关.
关键词： 酵母双杂交 vasostatin 基因功能 -
卵巢癌差异表达基因2氨基端PID结构域相互作用蛋白的筛选
目的:筛选人卵巢癌差异表达基因2(differentially expressed in ovarian cancer 2, DOC-2)氨基端磷酸酪氨酸作用结构域PID (nDOC-2)的相互作用蛋白质,为研究DOC-2作用的信号通路提供线索.方法:将含有人DOC-2氨基端PID结构域cDNA的片段插入酵母表达载体pGBKT7中构建诱饵质粒,转化酵母菌AH109并在其内表达,然后转化人胎脑cDNA文库,在营养缺陷培养基和X-α-半乳糖苷酶(X-α-gal)上进行双重筛选阳性克隆,PCR扩增出目的片段并测序,进行生物学分析,寻找与DOC-2氨基端PID结构域蛋白相互作用的蛋白质.结果:经过扩增和筛选胎脑cDNA文库,排除假阳性克隆,得到21个侯选阳性克隆,其中3个克隆进行了序列分析,它们是:Amyloid beta (A4) precursor-like protein 1(APLP1)、TGFβⅢ型受体的部分mRNA和protocadherin gamma subfamily C 3 (PCDHGC3).结论:获得的3个基因编码的蛋白可能参与了DOC-2的信号转导通路,为研究DOC-2在卵巢癌基因治疗中的作用提供了新的思路.
关键词： 人卵巢癌差异表达基因2 磷酸酪氨酸作用结构域 酵母双杂交 -
酵母LAG1同源的人类长寿保障新基因LASS2的克隆和功能研究
目的分离和克隆肝癌相关基因.方法我们用高通量功能筛选和RACE(rapid amplification of cDNA ends)方法从人肝cDNA文库中克隆到一个与酵母长寿保障基因LAG1高度同源的人类新基因LASS2(homo sapiens longevity assurance homologue2 of yeast LAG1).结果LASS2在正常人肝组织和肾组织中高表达,其表达谱不同于早先在人中克隆到的另一个与酵母LAG1高度同源的人类长寿保障基因LAG1 Hs-1.放射杂交基因定位显示LASS2位于人类染色体1q11,酵母双杂交和GST结合实验发现LASS2蛋白能与细胞中的几个膜相关受体或转运体相互作用;另外,LASS2在体外对人肝癌细胞的克隆形成具有抑制作用,提示该基因可能参与细胞的生长调控.结论LASS2是一个新的肝癌相关基因.
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SNT1与RET之间相互作用的酵母双杂交研究
目的:研究sucl-binding neurotrophic target(SNT1)与RET之间的相互作用,寻找RET受体下游的结合蛋白,以深入认识RET下游信号转导机制.方法:将RET胞内域与LexA蛋白融合作为DNA结合蛋白,分别将SNT1、SNT1PTB及SNT1△PTB与B42AD蛋白融合作为激活域蛋白,共转化酵母菌后,通过β-半乳糖苷酶活性检测以及氨基酸营养缺陷生长实验分析它们之间的相互作用.结果:SNT1及SNT1PTB与RET之间在酵母中存在结合,而SNT1△PTB不与RET结合.结论:证实RET与SNT1之间具有相互作用,SNT1的PTB结构域在介导此相互作用的过程中非常重要.
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Dok1与TrkA之间相互作用的酵母双杂交研究
目的:研究downstream of kinases1(dok1)与TrkA之间的相互作用,寻找TrkA的可能底物或调控蛋白,以深入认识TrkA下游信号转导机制.方法:将TrkA胞内域与LexA蛋白融合作为DNA结合蛋白,分别将dok1、dok1PTB及dok1ΔPTB与B42AD蛋白融合作为激活域蛋白,共转化酵母菌后,通过β-半乳糖苷酶活性检测以及氨基酸营养缺陷生长实验分析它们之间的相互作用.结果:dok1及dok1PTB与TrkA之间在酵母中存在结合,而dok1ΔPTB不与TrkA结合.结论:证实TrkA与dok1之间具有相互作用,dok1的PTB结构域在介导此相互作用的过程中非常重要.
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Dok1与表皮生长因子受体之间相互作用的酵母双杂交研究
目的:研究downstream of kinases(dok1)与表皮生长因子受体(EGFR)之间的相互作用,寻找EGFR的可能底物或调控蛋白,以深入认识EGFR下游信号转导机制.方法: 将EGFR胞内域与LexA蛋白融合作为DNA结合蛋白,分别将dok1、dok1PTB及dok1ΔPTB与B42AD蛋白融合作为激活域蛋白,共转化酵母菌后,通过β-半乳糖苷酶活性检测、生长实验以及免疫共沉淀实验分析它们之间的相互作用.结果: dok1及dok1PTB与EGFR之间在酵母中存在结合,而dok1ΔPTB不与EGFR结合. 结论: 首次证实EGFR与dok1之间具有相互作用,dok1的PTB结构域在介导此相互作用的过程中非常重要.
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酵母双杂交方法筛选与NGF受体TrkA相互作用的新蛋白质
目的:寻找新的TrkA可能底物或调控蛋白,以深入认识TrkA下游信号转导机制.方法:将TrkA胞内域与LexA蛋白融合作为诱饵蛋白,应用酵母双杂交方法筛选人脑LexAcDNA文库,经β-半乳糖苷酶活性鉴定和测序分析进一步鉴别,获得阳性克隆.结果:明确阳性克隆中的TrkAIC-BP1为一种新的TrkA结合蛋白.免疫共沉淀实验证实了TrkAIC-BP1和TrkA在酵母中的相互作用.结论:首次筛选到TrkA结合蛋白--TrkAIC-BP1,它可能在TrkA引起神经元分化的功能调控中起重要作用.
关键词： TrkA TrkAIC-BP1 酵母双杂交 -
酵母双杂交研究与RIG-G相互作用的蛋白
目的应用酵母双杂交技术研究能够与维甲酸诱导的G基因(RIG-G)发生作用的蛋白,以了解其功能. 方法应用酵母双杂交技术,以RIG-G为诱饵,筛选人类骨髓cDNA文库,寻找能与之相互作用的蛋白.利用生物信息学,一对一酵母回复性杂交,β-GAL实验等提供的信息,筛除假阳性克隆,确定阳性克隆. 结果经过酵母双杂交共获得109个克隆,经过验证,有24个阳性克隆,它们分别是细胞的信号传导蛋白、细胞骨架蛋白、激酶等. 结论为了研究诸如RIG-G新基因的功能,酵母双杂交技术是可靠的分子生物学技术.
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酵母双杂交报告基因β-半乳糖苷酶活性测定方法的研究
目的 建立标准的酵母双杂交系统报告基因表达的β-半乳糖苷酶活性测定方法.方法 采用o-硝基-β-D-半乳糖苷(ONPG)为底物,以液氮反复冻融破碎酵母细胞壁,通过比较不同测定时间、接种阳性克隆数目、转化方法以及酵母株对β-半乳糖苷酶酶活的影响,确定佳酶活测定条件. 结果相同条件下,单个克隆之间的酶活有差异,相对标准偏差(RSD)＞8%;相同条件下,Y187酵母株比AH109酵母株酶活高18～20倍,并且本底水平很低甚至没有;双倍体酵母的酶活介于两个单倍体酵母之间,同预计一致;质粒顺序转化与共转化在AH109 中差异有统计学意义(P＜0.001),而在Y187中没有明显差异(P＞0.05). 结论测定酵母双杂交报告基因β-半乳糖苷酶的活性宜采用Y187酵母株,酶活变化范围大,本底小,受转化方法影响小,测定时选取5个以上阳性克隆混合培养更有利于酶活的准确测定.
