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GST-G3BP Domain 1～5原核表达质粒的构建及其表达
目的:构建GST-G3BP Domain 1～5的融合表达质粒,并在大肠杆菌中稳定表达.方法:PCR扩增G3BP Domain 1～5片段,利用限制性内切酶geaR I和Not I将其连接至载体pGEX-4T-1,将连接产物转化大肠杆菌,挑取单菌落,提取质粒,经PCR和双酶切鉴定后测序.将转化正确的大肠杆菌过夜培养,IPTG诱导融合蛋白表达,immobilized Glu-tathione beads钓取目的蛋白.结果:G3BP Domain 1～5片段均成功连接至载体pGEX-4T-1,在大肠杆菌BL21中可得到稳定表达的融合蛋白.结论:GST-G3BP Domain 1～5的融合表达质粒构建成功.
关键词： G3BP 质粒构建 GST-pull down 融合蛋白 -
蛋白质相互作用研究技术的新进展
蛋白质相互作用网络基于蛋白质的生物学原理，它们之间的相互作用决定了分子与细胞水平上作用机制，从而起到调控机体健康和疾病状态的作用。此作用网络对于复杂的多基因疾病的靶向治疗领域的研究具有深远的意义[1]。本文着眼于酵母双杂交系统、串联亲和纯化、噬菌体展示、免疫共沉淀、GST-Pull down、Far-Western blotting、荧光共振能量转移、生物信息学等蛋白质相互作用研究方法，对其进行比较分析并进行综述。
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A型核纤层蛋白的C端相互作用蛋白的筛选及鉴定
目的:筛选A型核纤层蛋白(lamin A)相互作用蛋白,探讨lamin A造成细胞早老的机理.方法:以lamin A的C末端区域为诱饵蛋白,采用酵母双杂交方法从人骨骼肌cDNA文库中筛选lamin A相互作用蛋白.并采用GST-Pull down实验和western blotting进行鉴定.结果:筛选得到包括MT-2A在内的14个候选相互作用蛋白.MT-2A与lamin A能相互作用.结论:MT-2A在细胞外与lamin A相互作用.
关键词： 酵母双杂交 A型核纤层蛋白 衰老 GST-pull down -
P53蛋白的原核表达及纯化
目的 构建P53基因重组原核表达质粒,在大肠杆菌中表达融合蛋白并进行纯化.方法 以pBabe-P53R质粒为模板,PCR扩增P53基因全序列,克隆至pGEX-4T-1载体中,构建重组原核表达质粒pGEX-4T-1-P53,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达.表达产物经不同配比的去垢剂复性后,用Glutathione Sepharose 4Bgel亲和层析纯化.结果 重组原核表达质粒pGEX-4T-1-P53经双酶切鉴定,表明构建正确.表达的GST-P53融合蛋白相对分子质量约80 000,IPTG诱导时间以1 h为宜.1%Triton X-100和1 mmol/L EDTA为蛋白复性的佳去垢剂.纯化的GST-P53融合蛋白可与羊抗人GST抗体和鼠抗人P53抗体发生特异性反应.500 ml菌液可获得1 mg纯化蛋白.结论 已成功构建了P53基因重组原核表达质粒,表达并纯化了GST-P53融合蛋白,为研究NIRF与P53基因之间的相互关系奠定了基础.
关键词： p53基因 原核表达 纯化 GST-pull down -
GST-pull down技术在蛋白质相互作用中的应用
蛋白间相互作用在细胞的生命活动中起着关键作用,GST-pull down技术被广泛用于体外验证蛋白间的直接相互作用.GST-pull down技术既可用来验证已知蛋白间的相互作用,也可用来寻找与已知蛋白相互作用的未知蛋白.虽然该技术在体外验证蛋白间的相互作用上有着较强的特异性,但下结论时仍需慎重.本文就GST-pull down技术的原理及其应用及该技术在应用中需要注意的部分问题进行综述.
关键词： GST-pull down 蛋白质相互作用 融合蛋白 -
GJB6在hela细胞的互作蛋白的研究
目的 为探讨GJB6的组装、运输、膜定位及间隙连接通道形成的可能机制,在hela细胞筛选GJB6的C-端功能域的互作蛋白.方法 以正常人DNA为模板,PCR扩增GJB6(CX30)的211～261氨基酸编码区,即C-端功能域,构建pGEX-4T-2-GJB6(211～261)-GST原核融合表达载体,纯化融合蛋白和GST蛋白,以纯化的融合蛋白和GST蛋白分别与hela细胞的裂解蛋白进行孵育以沉降(pull down)互作蛋白,SDS-PAGE分离互作蛋白.结果 构建了pGEX-4T-2-GJB6(211～261)-GST原核融合表达载体,纯化了融合蛋白及GST蛋白,但在对沉降所得蛋白进行SDS-PAGE分离、检测及比较,未发现明显差异蛋白条带.结论 本实验虽未能在hela细胞筛选到GJB6的C-端功能域的互作蛋白,但构建了融合表达载体,纯化了融合蛋白及GST,为进一步GJB6的互作蛋白筛选打下了基础.
关键词： GJB6 互作蛋白 GST-pull down Hela细胞
