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与PIH1D1相互作用的蛋白分析
目的 分析细胞中与PIH1D1相互作用的蛋白.方法 构建稳定表达FLAG-HA双标签标记的PIH1D1蛋白的HEK293T细胞株,利用FLAG-HA串联亲和纯化(TAP)双标签纯化实验,对目的条带进行质谱分析.结果 成功构建稳定表达FLAG-HA双标签标记的PIH1D1细胞株.通过质谱分析得到了PIH1D1相互作用的蛋白数据,包括细胞质内RNA PolⅡ组装复合物成员RPAP3、UXT、PFD2和PFD6等,凋亡复合物成员MONAD/WDR92等,钙调蛋白信号通路中的PIP和CALM1以及代谢通路中的PKM和LCN1等.结论 PIH1D1与细胞中RPAP3、UXT、PFD2、PFD6、MONAD/WDR92、PIP、CALM1、PKM和LCN1等相互作用,提示PIH1D1可能参与细胞中RNApol Ⅱ组装、细胞凋亡、钙调蛋白通路等多种生理过程.
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登革病毒非结构蛋白NS4A的克隆表达及与其相互作用蛋白质的亲和纯化
目的 克隆表达登革病毒非结构蛋白NS4A,分离纯化与其相互作用的细胞蛋白.方法 用特异性引物PCR扩增出FLAG-NS4A-HA基因片段,克隆至真核表达载体pSG5中,将重组质粒通过脂质体法瞬时转染入A549细胞,并通过Western blot检测NS4A融合蛋白的表达情况.利用串联亲和纯化系统(TAP)纯化分离与NS4A相互作用的蛋白,Western blot技术及银染SDS-PAGE验证NS4A蛋白复合物的纯化和分离情况.结果 成功构建NS4A蛋白融合表达载体和FLAG、HA串联亲和纯化系统,SDS-PAGE和银染结果显示TAP系统分离得到了NS4A蛋白带和2条可能与NS4A相互作用的蛋白质片段.结论 成功分离纯化与NS4A相互作用的细胞蛋白,为进一步研究机体抗登革病毒感染的机制奠定了基础.
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CUL4A-DDB1细胞稳定株筛选及DNA双链断裂模型构建
目的 为了鉴定并验证CUL4A-DDB1泛素连接酶复合体中参与DNA损伤修复反应过程的1~2种关键成分在损伤识别、早期及晚期修复中的动态变化,拟构建含有串联亲和纯化(TAP)标签载体并筛选高表达CUL4A/ DDB1的细胞株,建立DNA双链断裂模型.方法 利用PCR获得CUL4A/DDB1基因,构建重组表达载体pNTAP-A-CUL4A/ DDB1;使用顺铂和电离辐射刺激等外界刺激建立合适的DNA双链断裂细胞模型,使用G418筛选稳定表达CUL4A/ DDB1的细胞株.结果 与结论 成功构建pNTAP-A-CUL4A/ DDB1表达载体,建立合适的DNA双链断裂细胞模型,筛选得到稳定表达CUL4A/ DDB1的细胞稳定株,为下一步质谱分析CUL4A-DDB1泛素连接酶在DNA损伤修复过程中的新功能打下基础.
关键词： DNA损伤 CUL4A-DDB1 串联亲和纯化 -
关键词：
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蛋白质相互作用研究的常用方法进展及比较
如今蛋白质间的相互作用已成为生命科学领域研究的重点,而各种蛋白质间相互作用的研究方法的飞速发展成为蛋白质研究的重点.本综述中将着眼于酵母双杂交方法新进发展与Sos系统、噬菌体展示、GST-pull down、免疫共沉淀、串联亲和纯化等蛋白质相互作用研究方法做一比较分析.以便在未来的研究中,根据不同方法的优缺点选择合适的研究技术.
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利用串联亲和纯化结合质谱分析分离和鉴定与蛋白激酶NLK结合的蛋白复合物组分
目的 利用串联亲和纯化结合质谱分析分离和鉴定与蛋白激酶NLK结合的蛋白复合物组分.方法 将RFP、NLK和其突变体NLKK155M克隆至本室改造的带有Flag和Strep双标签的反转录病毒载体pMSCVpuro中,通过酶切鉴定并测序验证其构建的正确性.采用反转录病毒感染结合嘌呤霉素筛选的方法,获得稳定表达RFP、NLK、NLK突变体NLKK155M的HCT-116细胞株,Western blot法检测目的蛋白RFP、NLK和NLKK155M的表达.采用串联亲和纯化结合质谱分析,分离、鉴定与NLK结合的蛋白.结果 构建的pMSCVpuro/N-Flag-Strep-RFP和pMSCVpuro/N-Flag-Strep-NLK质粒经酶切鉴定、测序证明质粒构建正确,pMSCVpuro/N-Flag-Strep-NLK155M质粒经测序证明构建正确.携带上述基因的反转录病毒感染的HCT-116细胞,Flag-Strep-RFP、Flag-Strep-NLK和Flag-Strep-NLKK155M均正常表达.经串联亲和纯化和质谱分析,发现多个可能与NLK结合的蛋白.结论 本研究采用串联亲和纯化结合质谱分析成功鉴定了若干可能与NLK及其突变体NLKK155M结合的蛋白质.
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串联亲和纯化技术在研究细胞内相互作用蛋白质中的应用
为了进一步研究蛋白质功能并建立蛋白质在细胞内的相互作用网络,各种研究相互作用蛋白质的方法应运而生,串联亲和纯化(TAP)技术就是其中之一.TAP利用基因重组技术将标签基因融合入靶蛋白基因,转入细胞系后表达带标签的靶蛋白,使用标签的特异性对靶蛋白进行纯化和相关研究,而该技术在实际运用会遇到标签选择、标签位置的选择和重组表达等一系列问题,该文介绍TAP技术在实际使用中的技术要点.
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寻找受体分子研究方法的进展
配体与受体间的识别及相互作用是分子发挥其功能的重要途径，具有重要的生物学意义。但是，寻找某一分子的受体并不容易，往往成为研究的瓶颈所在。目前寻找及验证某一对配体／受体分子及其对应关系的方法有很多，包括免疫共沉淀、噬菌体展示、酵母双杂交、分子模拟、谷胱甘肽巯基转移酶pull－down、串联亲和纯化等。该文对这些方法的基本原理、简要步骤及优缺点进行综述，为相关研究提供依据。
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串联亲和纯化技术筛选Bat3的相互作用蛋白质
目的 寻找与Bat3结合的蛋白质.方法采用串联亲和纯化技术,在Bat3编码序列羧基端融合Strep2和FLAG 2个分子标签,以此为诱饵筛选与其特异结合的蛋白质,后进行质谱鉴定.结果 筛选到1种蛋白质分子,命名为Ubl4A,免疫共沉淀结果显示Ubl4A可与Bat3相互结合.结论 成功建立了串联亲和纯化技术平台,分离出可与Bat3相互作用的蛋白质Ubl4A.
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蛋白质组学的相关技术研究进展
目前,生物学研究已进人后基因组时代,一个以"蛋白质组"为研究重点的生命科学新时代已悄然到来.近年来,蛋白质组技术发展迅速,激光捕获微切割、蛋白质芯片、同位素包被亲和标记等新技术,促进了蛋白质组学的发展.综述了近年蛋白质组学相关新技术的进展及其应用情况.
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蛋白质相互作用研究技术的新进展
蛋白质相互作用网络基于蛋白质的生物学原理，它们之间的相互作用决定了分子与细胞水平上作用机制，从而起到调控机体健康和疾病状态的作用。此作用网络对于复杂的多基因疾病的靶向治疗领域的研究具有深远的意义[1]。本文着眼于酵母双杂交系统、串联亲和纯化、噬菌体展示、免疫共沉淀、GST-Pull down、Far-Western blotting、荧光共振能量转移、生物信息学等蛋白质相互作用研究方法，对其进行比较分析并进行综述。
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串联亲和标签LOX蛋白慢病毒表达载体的构建及在乳腺癌细胞中的表达
目的:为了研究赖氨酰氧化酶(Lysyl Oxidase,LOX)及其相互作用蛋白质在乳腺癌中的功能,构建带Strep Ⅱ/FLAG串联亲和标签的重组LOX蛋白慢病毒表达载体并在乳腺癌细胞MDA-MB-231中表达.方法:设计引物通过聚合酶链式反应获得带StrepⅡ/FLAG串联亲和标签的LOX蛋白(Lox-sF)的亲本质粒,双酶切后鉴定测序克隆至GV303表达载体,连同慢病毒包装质粒共同转染293T得到GV303/LOX-SF慢病毒,将其转染MDA-MB-231细胞,使用荧光定量PCR和蛋白质印迹实验对细胞中重组蛋白LOX-SF进行检测.结果:通过串联亲和纯化获得LOX-SF重组蛋白,使用标签抗体成功鉴定到LOX-SF重组蛋白在MDA-MB-231细胞内稳定表达.结论:GV303/LOX-SF的构建,使带StrepⅡ/FLAG融合标签的LOX蛋白在MDA-MB-231中成功表达及纯化,为筛选和研究LOX及其相互作用蛋白在乳腺癌细胞内的功能奠定了实验基础.
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重组蛋白质亲和标签的选择与串联亲和纯化的应用进展
重组蛋白质技术作为蛋白质研究的重要手段之一,在生物化学与生物物理学研究领域,扮演着极其重要的角色.亲和纯化作为为方便与快捷的重组蛋白质纯化手段,日益得到广泛的应用.由于各种亲和标签,纯化介质层出不穷,性质各异.应根据自身研究对象具体情况选择合适的亲和纯化标签.近年双亲和标签进行串联亲和纯化日益成为蛋白质相互作用研究的重要方法.多种亲和标签的搭配已得到成功应用,部分已进入商业化,并在各种模式生物中得到广泛的应用,本文就重组蛋白质亲和标签的选择与串联亲和纯化作一综述.
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串联亲和纯化(TAP)技术的研究进展
蛋白质是各种生命活动的主要执行者,对揭开各种细胞活动的奥秘以及对促进蛋白分析技术的发展都十分重要,因此在客观上要求建立新的蛋白纯化策略.串联亲和纯化(TAP)是近年来发展出来的一种新的纯化蛋白复合物的技术,能够快速研究在生理条件下蛋白质相互作用,已成为研究蛋白质组学的一个重要工具.本文从该技术的每一层面入手,对此方法 的原理、发展和应用做一综述.
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布氏锥虫未知CCCH-型锌指蛋白TbZC3H8功能特性的初步分析
目的 通过RNAi和蛋白复合物鉴定来初步分析布氏锥虫未知锌指蛋白TbZC3H8的特性及功能.方法 运用蛋白数据库和分析软件对TbZC3H8进行序列分析和结构域预测；构建RNAi诱导表达细胞株分析TbZC3H8经RNAi敲低后对锥虫生长的影响,并通过RT-QPCR和Western blot检测RNAi干扰效率；构建异位融合表达myc-TAP标签的TbZC3H8细胞株,采用串联亲和纯化合并质谱鉴定其蛋白复合物组成；采用免疫荧光分析蛋白定位.结果 TbZC3H8的CCCH结构域在动基体原虫中高度保守；RNAi下调TbZC3H8后明显抑制了锥虫复制；TbZC3H8蛋白复合物中包含多种未知蛋白和两种RNA结合蛋白；TbZC3H8蛋白定位于胞质中,血清饥饿和热刺激对其定位无影响.结论 TbZC3H8是锥虫生长必需的,TbC3H8与RNA结合蛋白的相互作用暗示其可能在RNA加工代谢中发挥着作用.
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串联亲和纯化技术筛选肠病毒71型3D聚合酶的相互作用蛋白
目的 利用串联亲和纯化技术筛选与肠病毒71型3D聚合酶相互作用的宿主细胞蛋白.方法 利用RT-PCR方法从EV71BrCr株全基因组中获得3D聚合酶全长基因,构建pcDNA3.0-3D-Flag-HA真核表达载体并转染RD细胞,48 h后收集细胞.用Western blot方法检测3D蛋白在RD细胞内的表达情况.串联亲和纯化技术筛选与3D聚合酶相互作用的宿主蛋白并进行质谱分析,确定与3D聚合酶相互作用的蛋白或多肽.并采用免疫共沉淀实验,对候选蛋白CyclinG1与3D的相互作用进行验证.结果 成功构建了pcDNA3.0-3D-Flag-HA载体,在RD细胞内检测到3D蛋白的表达.经串联亲和纯化和质谱分析得到LATS2、Nek2、APC5、CyclinG1、PI3K等一系列参与细胞凋亡及细胞周期调控的蛋白.免疫共沉淀实验证实3D蛋白与CyclinG1的相互作用.结论 3D聚合酶可能与宿主细胞内蛋白相互作用,引起细胞凋亡及细胞周期改变.
关键词： 肠道病毒71型 3D聚合酶 串联亲和纯化 液相色谱-质谱分析法 -
树突状细胞中Rab40b/c相互作用蛋白质的鉴定研究
目的 改进串联亲和纯化质谱(TAP-MS)技术,鉴定并验证Rab40b和Rab40c在树突状细胞中的相互作用蛋白质.方法 用分子克隆技术构建融合蛋白基因eXact-6×His-EYFP-Rab40b和eXact-6×His-EYFP-Rab40c的表达载体,采用慢病毒感染建立融合蛋白eXact-6×His-EYFP-Rab40b和eXact-6×His-EYFP-Rab40c稳定表达的树突状细胞系.改进串联亲和纯化技术,通过eXact-6×His标签进行新型串联亲和纯化和qTOF液质检测,运用CompPASS算法过滤和GO富集分析,鉴定Rab40b和Rab40c的相互作用蛋白,并采用免疫共沉淀验证.结果 成功构建eXact-6×His-EYFP-Rab40b和eXact-6×His-EYFP-Rab40c融合蛋白稳定表达的树突状细胞系.采用新型串联亲和纯化方法,鉴定获得26个Rab40b高可信相互作用蛋白和16个Rab40c高可信相互作用蛋白.Rab40b、Rab40c分别与ElonginB、ElonginC、Cullin5具有相互作用.结论 成功建立新型串联亲和纯化方法.ElonginB、ElonginC、Cullin5是Rab40b、Rab40c的相互作用蛋白.
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乙型肝炎病毒核心抗原在人肝癌细胞株HepG2中的相互作用蛋白研究
目的 利用串联亲和纯化和液相质谱技术研究HBcAg在人肝癌细胞株HepG2中的相互作用蛋白.方法 构建HBcAg重组质粒pMSCV-HBc,采用串联亲和纯化技术富集HepG2细胞中HBcAg结合蛋白,电泳分离免疫沉淀复合物并从胶中切取HBcAg结合蛋白条带,胶内酶解后进行液相质谱技术分析从而鉴定HBcAg相互作用蛋白.结果 成功构建HBcAg重组表达载体,在HepG2细胞中筛选到4个HBcAg相互用蛋白:CD59糖蛋白前体、MCM3相关蛋白、LOC100049716蛋白和ANKRD26蛋白.结论 人肝癌细胞中HBcAg相互作用蛋白CD59等可能在HBV感染中起到重要作用.
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HepG2细胞中RORγ相互作用蛋白的筛选及鉴定
目的 筛选HepG2细胞中转录因子RORγ(the retinoid-related orphan nuclear receptor gamma)相互作用蛋白,并对这些蛋白进行初步鉴定,为阐述RORγ介导调节HepG2细胞中各种生理学进程提供理论依据.方法 从HepG2细胞中克隆RORγ基因并连接入载体pCeMM CTAP(SG)中形成RORγ-CTAP (SG)融合基因,再将其亚克隆入含嘌呤霉素抗性基因的载体质粒中,构建pMSCVpuro RORγ-CTAP(SG)质粒；稳定转染HepG2细胞并对RORγ-CTAP(SG)融合基因的表达和定位进行检测后,进行大规模扩增培养；用TAP(串联亲和纯化)方法捕获RORγ相互作用蛋白,通过银染找出差异性蛋白条带,质谱鉴定得到候选RORγ相互作用蛋白；用免疫共沉淀方法对候选蛋白RORγ相互作用蛋白进行验证鉴定.结果 成功构建了质粒pMSCVpuro RORγ-CTAP(SG)并得到稳定转染HepG2细胞株,同时RORγ-TAP(SG)融合基因能定位表达于细胞核内；通过TAP方法获得了RORγ蛋白复合物,然后通过串联质谱分析和数据库搜索从银染差异性显著蛋白条带中找到7个候选RORγ相互作用蛋白；用RORγ蛋白进行免疫共沉淀,对纯化出的7个RORγ相互作用蛋白分别检测,证实了RIP140,HSP90和RORγ在HepG2中有相互作用关系.结论 筛选并鉴定了HepG2细胞中蛋白RORγ的相互作用蛋白RIP140和HSP90,这些研究发现支持了RORγ是共调解蛋白依赖的转录因子且以复合物形式行使功能的假说.其中,HSP90可能扮演分子伴侣角色,而RIP140在HepG2细胞中则可能充当RORγ蛋白的转录调控伙伴蛋白,具体机制有待进一步研究.
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2型登革病毒非结构蛋白NS3的表达及其相互作用蛋白的纯化
目的 构建2型登革病毒(DENV2)非结构蛋白3(NS3)与亲和标签融合蛋白的表达质粒,串联亲和纯化(TAP)法获得与NS3相互作用的蛋白.方法 根据DENV2基因序列,设计引物;以DENV2 cDNA为模板,PCR扩增出NS3基因,经酶切后克隆至含有串联亲和标签(FLAG-StrepⅡ)的哺乳真核表达载体pCI-SF,获得重组表达质粒pCI-NS3-SF;将上述重组质粒通过转染试剂LipofectamineTM 2000瞬时转染进入HEK293T细胞,Westem blot法验证NS3融合蛋白的表达;通过TAP法分离纯化与NS3相互作用的蛋白.结果 成功构建了NS3融合蛋白表达载体,利用TIAP系统分离得到与NS3蛋白相互作用的宿主蛋白.结论 串联亲和纯化法可以有效的分离与DENV2 NS3相互作用的细胞蛋白.
