首页 > 文献资料
-
埃博拉病毒糖蛋白与宿主细胞相互作用蛋白的筛选及生物信息学分析
目的 筛选埃博拉病毒糖蛋白在人源宿主细胞内的相互作用组分,为埃博拉病毒受体研究提供基础数据.方法 制备埃博拉病毒糖蛋白GP1亚基人IgG-Fc标签融合蛋白,进行Pull-Down试验和质谱分析,经生物信息学分析确定关键相互作用因子. 结果 共筛选出31种潜在的与宿主细胞相互助用的埃博拉病毒糖蛋白,该类蛋白或为细胞结构成分,或为转录因子并参与信号转导等生物学过程;有10种蛋白参与20种信号通路,主要包括免疫反应、细胞黏附、致病性、病原感染等4大类信号通路. 结论 成功筛选与人源细胞相互作用的埃博拉病毒糖蛋白,其中部分蛋白在细胞生命活动中起重要作用.
-
蛋白质相互作用研究的常用方法进展及比较
如今蛋白质间的相互作用已成为生命科学领域研究的重点,而各种蛋白质间相互作用的研究方法的飞速发展成为蛋白质研究的重点.本综述中将着眼于酵母双杂交方法新进发展与Sos系统、噬菌体展示、GST-pull down、免疫共沉淀、串联亲和纯化等蛋白质相互作用研究方法做一比较分析.以便在未来的研究中,根据不同方法的优缺点选择合适的研究技术.
-
Nav1.2 IQ及其癫痫突变体的表达纯化和活性鉴定
目的 构建电压门控性钠通道亚型Nav1.2 IQ片段及其癫痫突变体的质粒,制备高浓度和高纯度的体外重组蛋白并进行活性鉴定.方法 将Nav1.2IQ片段及癫痫突变体的cDNA插入pGEX-6p-1质粒载体后,转化大肠杆菌BL21感受态细胞,利用异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)诱导Nav1.2IQ片段及癫痫突变体GST融合蛋白表达,GS-4B beads进行分离纯化.应用SDS-PAGE检测目的蛋白纯度和相对分子质量;采用Bradford方法测定GST蛋白浓度;应用pull-down法检测纯化后蛋白的活性.结果 Nav1.2IQ片段及其癫痫突变体在体外大肠杆菌中具有较高的纯度和表达量,与钙调蛋白在体外能够直接结合,证明制备的蛋白片段具有一定活性.结论 成功分离纯化了稳定高效的体外重组Nav1.2 IQ及其癫痫突变体蛋白,为研究Nav1.2与相关调节因子在癫痫发病的作用提供理论依据.
-
DOC-1R缺失型原核表达载体的构建及其重组蛋白的纯化
目的 构建DOC-1R(deleted in oral cancer-I related)缺失型原核表达载体并纯化其重组蛋白,用于进一步研究DOC-1R互作蛋白及DOC-1R与其相互作用区域.方法 经基因重组技术构建分别缺失DOC-1R N端1/3序列及其C端1/3序列的原核表达载体,经测序鉴定、转化至E.coli BL21菌株后,诱导表达两种缺失型GST-DOC-1R重组蛋白,并获得纯化的重组蛋白.结果 两载体克隆序列及开放阅读框架均正确,经IPTG诱导在35kD处获得重组蛋白,纯化后得到大量GST-DOC-1R缺失型重组蛋白.结论 成功构建了两种pGEX-DOC-1R缺失型原核表达载体,表达并纯化出GST-DOC-1R delN42、GST-DOC-1R delC42融合蛋白.
-
钙调蛋白的N末端和C末端片段载体构建和蛋白制备
目的 构建钙调蛋白(CaM)的N末端片段(N-lobe)、C末端片段(C-lobe)及其钙离子(Ca2+)结合位点突变体(N-lobe12,C-lobe34)原核表达载体并进行蛋白表达、纯化和活性鉴定.方法 将上述cDNA片段插入PGEX-6p-3质粒载体后转化大肠杆菌BL21感受态细胞,异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白表达.利用Glutathione-Sepharose 4B beads进行分离纯化.采用SDS-PAGE检测目的蛋白纯度和相对分子质量,Bradfo rd方法测定纯化后蛋白浓度,GST pull-down方法和膜片钳技术检测纯化后蛋白活性.结果 蛋白高表达,纯化后获得高纯度、高浓度目的蛋白,纯化后蛋白能与Cav l.2型钙通道结合并可恢复已“rundown”心肌细胞膜钙通道的活性.结论本研究成功构建可以表达生物活性蛋白的N-lobe、C-lobe、N-lobe12及C-lobe34原核表达载体,为深入研究CaM的生物学功能奠定了基础.
-
PreIQ及其突变体载体构建表达纯化和活性鉴定
目的 构建心肌L型钙通道片段PreIQ及其突变体与谷胱甘肽转移酶(GST)重组的融合蛋白原核表达载体并进行表达纯化和活性鉴定.方法 将PreIQ及其突变体的cDNA插入pGEX-6p-1质粒载体后,转化大肠杆菌BL21感受态细胞,大量培养并利用异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)诱导PreIQ及其突变体的GST融合蛋白表达,GS-4B beads进行分离纯化.采用SDS-PAGE鉴定目的蛋白分子质量和相对纯度.采用Bradford方法测定纯化后蛋白浓度.采用pull-down法检测纯化后蛋白的活性.结果 PreIQ及其突变体融合蛋白得到了大量表达;纯化的PreIQ及其突变体具有较高的纯度;纯化后蛋白能与钙调蛋白(CaM)结合,具有生物活性.结论 本研究成功构建了PreIQ及其突变体融合蛋白原核表达载体,获得具有生物活性的PreIQ及其突变体融合蛋白,为深入研究PreIQ的生能学功能奠定基础.
-
鸡B-FA分子中结合Ii链功能片段特性的研究
目的：：研究鸡Ii链结合的B-FA分子的功能片段及其特征。方法：将克隆的B-FA基因片段(α1α2、sα1α2和α3TC)分别插入原核或真核表达质粒,然后分别转染或与Ii共转染工程菌E. coli(BL-21)或293T细胞,经过诱导表达、亲和层析纯化和SDS-PAGE鉴定后,分别用Pull-down法观察B-FA片段与Ii结合与在细胞内的共定位特征。结果：首先,构建了3个重组原核表达质粒和4个重组真核表达质粒。原核表达的B-FA片段经亲和层析纯化可获得单一蛋白分子。其次,用Pull-down从共转染工程菌表达的蛋白分子中分别检测到Ii/B-FA-α1α2和Ii/B-FA-sα1α2,而未能检测到Ii与α3TC的结合物,而免疫印迹结果也表明该两片段是结合Ii链形成复合物的功能片段。后,在真核表达的293T中,B-FA-α1α2具有同B-FA相同的细胞定位特性。结论：鸡B-FA-α1α2片段是结合Ii的功能片段,并保持了B-FA的细胞定位的作用。本研究结果首次提供了B-FA分子与Ii的互相作用的实验依据。
-
鸡Ii与B-L基因表达产物的细胞定位与结合活性特征
目的：研究鸡Ii与B-L基因表达产物在细胞内定位和互相结合的活性特征。方法：将克隆的Ii、B-LA和B-LB基因片段分别插入原核或真核表达质粒；然后分别单独转染或共转染工程菌Rosetta(DE3）或293T细胞。所有重组菌经鉴定后进行诱导表达后再复性。单一表达产物用免疫印迹检测它们的抗原性，共转染表达的产物用pull-down法和( SDS-） PAGE观察其互相结合特征。结果：成功构建了6个原核和真核表达重组质粒。在真核细胞中Ii、B-LA和B-LB基因表达产物定位于细胞浆膜，而原核表达产物经复性后和亲和层析纯化，获得单一蛋白分子。其次，原核表达的Ii 与B-LA和B-LB复性蛋白能够诱导产生鼠源抗体，这些抗体特异性结合真核表达产物，表明它们保持相同的免疫原性。后，用pull-down从共转染的工程菌表达并复性的蛋白分子中分别获得纯化的Ii／B-LA和Ii／B-LB复合物，它们经SDS处理后分别被解离成单体。结论：鸡Ii和B-L基因的原核与真核表达的产物能够保持其抗原性，而原核共表达的Ii和B-L蛋白分子复性后可以互相结合。本研究的结果为进一步研究Ii与B分子关系提供了方法。
