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致肾盂肾炎大肠埃希菌毒力的研究
目的 了解致肾盂肾炎大肠埃希菌(UPEC)毒力因子的致病性,为研究UPEC的致病机制奠定基础. 方法 用PCR方法扩增41株UPEC菌株和40株健康人粪便分离的大肠埃希菌6种毒力因子基因.取24只雌性BALB/c小鼠,随机分为A、B、C3组,A、B组分别用UPEC J96和E.coli K-12 p678-54(无菌毛株)菌液经尿道逆行感染,C组为空白对照,经尿道注入无菌PBS.感染5d后比较3组小鼠尿液和肾脏菌落计数(RCD)以及肾脏组织病理学检查结果.结果 PCR检测UPEC和健康人粪便分离大肠埃希菌6种毒力因子基因pa pC、fimH、hly、cnf1、aer和R049的检出率分别为100％和2.50％,53.66％和5.00％,63.41％和10.00％,34.15％和5.00％,60.98％和35.00％,40.00％和7.50％,差异均有统计学意义(P均＜0.01).A组(UPEC J96感染)小鼠尿液和肾组织培养均有细菌生长(细菌鉴定为pa pC阳性),菌落计数RCD值绝大多数＞3+;B组(E.coli K-12 p678-54感染)小鼠中有1只尿液和肾组织细菌培养阳性(细菌鉴定papC阴性),菌落计数为1+.C组(空白对照)小鼠尿道与肾脏均无细菌生长.A组与B组小鼠尿道和肾脏RCD均值(x±s)分别为4.25±0.707、5.75±1.669和0.125±0.354、0.125±0.354,差异均有统计学意义(P＜0.01或P＜0.05).病理检查A组有4只小鼠肾组织出现较为明显的炎症变化,B组肾组织未发现明显病变,C组肾组织结构清晰,无病理变化. 结论 6种毒力因子与UPEC致病性相关,建立的UPEC感染小鼠模型对UPEC致病机制的研究具有重要意义.
关键词： 尿路感染 致肾盂肾炎大肠埃希菌 毒力因子 动物模型 -
致肾盂肾炎大肠埃希菌新基因R049免疫保护作用的研究
目的 克隆和表达致肾盂肾炎大肠埃希菌(UPEC)132新基因R049,研究R049重组蛋白对小鼠的免疫保护作用. 方法 利用PCR定向克隆方法构建R049基因原核表达系统,表达后通过镍亲和层析纯化获得R049重组蛋白,制备鼠多克隆抗体.重组蛋白与UPECl32全菌蛋白经SDS-PAGE和Western blot分析,继而R049重组蛋白免疫BALB/c小鼠,用同源菌对小鼠经尿道上行感染,比较免疫组与对照组小鼠尿液与肾脏细菌计数差异. 结果 成功构建重组株E.coli BL21(DE3)/pET32a-R049 ORF,重组蛋白相对分子质量(M,)约为66.9×103,纯化后其纯度达到95%,制备多克隆抗体效价为≥l:102 400.Western blot证实重组R049蛋白与UPECl32全菌蛋白均能与小鼠抗血清发生特异性反应.动物实验结果表明尿液和肾脏菌落计数在免疫组均明显低于对照组(P
关键词： 致肾盂肾炎大肠埃希菌 R049基因 克隆表达 免疫保护 动物实验 -
致肾盂肾炎大肠埃希菌132基因组DNA消减文库的构建
目的:应用抑制性消减杂交技术,构建致肾盂肾炎大肠埃希菌132株(UPEC132)与已完成基因组测序的非致病性大肠埃希菌标准株MG1655的基因组DNA消减文库.方法:分别提取UPEC132与MG1655的基因组DNA,经Rsa I酶切成为大小200～800bp的片段,一部分与接头连接作为tester,和未与接头连接的酶切片段(driver)进行2次消减杂交及2次抑制性PCR后将产物与pMD18-T载体连接构建DNA消减文库,并转化给大肠埃希菌TOP10构建消减文库.结果:文库扩增后得到139个克隆,经PCR法快速测定,均得到200～800 bp的插入片段.结论:所构建的基因组DNA消减文库为进一步筛选UPEC132中与致病相关基因奠定了基础.
关键词： 致肾盂肾炎大肠埃希菌 抑制性消减杂交 聚合酶链式反应 -
致肾盂肾炎大肠埃希菌对细胞的粘附及侵袭
目的:研究致肾盂肾炎大肠埃希菌(UPEC)132对细胞的粘附和侵袭能力.方法:对比致病菌株UPEC132及无菌毛代表菌株E.coli K-12 p678-54对Vero、Ketr-3及EJ细胞的粘附率、粘附指数和侵袭指数.结果:E.coli K-12 p678-54对此3种细胞无粘附无侵袭,而UPEC132对其有明显作用,可致细胞形态明显改变直至死亡.UPEC132对Vero、Ketr-3及EJ细胞的粘附率分别为(61.44±3.21)%、(55.22±4.09)%和(58.67±5.12)%,差别无统计学意义;对3种细胞的粘附指数分别为1.44±0.06、1.74±0.09和2.27±0.18,有显著性差异(P＜0.05).UPEC132对EJ和Ketr-3细胞的侵袭指数分别为(3.25±0.20)×10-3和(3.00±0.34)×10-3,两者之间无统计学差异,但均高于对Vero细胞的侵袭指数[(2.61±0.32)×10-3,P＜0.05].结论:UPEC132对Vero、Ketr-3、EJ细胞均有粘附和侵袭能力,其中对EJ细胞的粘附能力强,侵袭力也较Vero细胞强,可利用该细胞深入研究UPEC132的毒力及致病机制.
关键词： 致肾盂肾炎大肠埃希菌 粘附 侵袭 -
P菌毛粘附素在致肾盂肾炎大肠埃希菌对小鼠尿道上行感染中的作用
目的比较2株具有不同P菌毛粘附素(PapG)的同血清型UPEC和1株无菌毛大肠埃希菌对小鼠泌尿道上行感染性的差异,探讨粘附素在UPEC尿道感染中的作用.方法通过UPEC尿道内接种形成BALB/c小鼠尿道上行感染,观察尿液、肾脏剖面的菌落计数和肾组织的病理改变.结果具有P菌毛的UPEC菌株感染之小鼠,在其尿液和肾剖面培养出大量原感染菌,肾组织呈现中、重度急性肾盂肾炎的病理改变;不同P菌毛粘附素的UPEC感染的菌落计数、肾脏病理改变严重度无显著性差异;无菌毛大肠埃希菌感染之小鼠,其尿液和肾剖面只有少量原感染菌生长,肾组织为轻至中度急性炎症改变.结论具有不同粘附素之P菌毛在介导UPEC致小鼠上行性急性肾盂肾炎中均发挥重要作用;无菌毛大肠埃希菌亦可导致小鼠肾脏炎性改变.
关键词： 致肾盂肾炎大肠埃希菌 PapG粘附素 尿道上行感染 -
致肾盂肾炎大肠埃希菌粘附素重组蛋白诱导小鼠免疫应答
目的获得UPEC P菌毛粘附素PapG重组蛋白纯化产物,研究其诱导小鼠的免疫应答,为进一步的PapG疫苗及免疫学研究创造条件.方法 GST-PapG重组蛋白经诱导表达和亲和层析纯化后接种于BALB/c小鼠;ELISA法检测小鼠免疫血清的抗体效价,以血凝抑制试验测定其免疫反应性.结果重组蛋白纯化产物可诱导小鼠产生针对PapG粘附素的特异性免疫应答,免疫小鼠血清抗体的效价显著升高,而且具有较强的血凝抑制作用.结论 GST-PapG重组蛋白纯化产物具有良好的免疫原性,可用于UPEC抗粘附候选疫苗的筛选和进一步的免疫学研究.
关键词： 致肾盂肾炎大肠埃希菌 PapG粘附素 重组蛋白 免疫应答
