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尿道致病性大肠杆菌新基因R049特征的研究
目的 明确从国内分离的尿道致病性大肠杆菌(UPEC) 132中发现的新基因R049的特征及其表达蛋白在菌体内的定位。方法 提取UPEC132染色体DNA，鸟枪法构建文库，高通量焦磷酸法测序，Newbler软件拼接，进行生物信息学分析，确定R049相关片段的特征。提取UPEC132的内膜和外膜蛋白，与其全菌裂解物一起进行SDS-PAGE，用R049重组蛋白抗血清进行Western blot，确定R049表达蛋白的菌体内位置。结果 成功构建UPEC 132染色体文库，获取R049-contig169022 bp，与UPEC536染色体第233074至451502位碱基序列同源性较高，其中含有R049基因的20773 bp片段替代相当于UPEC536染色体上PAIⅢ536的位置，G+C含量为46.97％，两端具有正向重复序列，并与插入元件整合酶基因和thrW tRNA基因相邻，包含25个ORF，命名为R049 -GI。R049基因位于R049-GI的第13个ORF。SDS-PAGE和Western blot分析显示R049基因表达相对分子质量为47.0× 103蛋白是UPEC132的外膜蛋白。结论 R049基因编码细菌的外膜蛋白，是UPEC132通过基因水平转移获得的染色体基因组岛的组成部分。
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致肾盂肾炎大肠埃希菌新基因R049免疫保护作用的研究
目的 克隆和表达致肾盂肾炎大肠埃希菌(UPEC)132新基因R049,研究R049重组蛋白对小鼠的免疫保护作用. 方法 利用PCR定向克隆方法构建R049基因原核表达系统,表达后通过镍亲和层析纯化获得R049重组蛋白,制备鼠多克隆抗体.重组蛋白与UPECl32全菌蛋白经SDS-PAGE和Western blot分析,继而R049重组蛋白免疫BALB/c小鼠,用同源菌对小鼠经尿道上行感染,比较免疫组与对照组小鼠尿液与肾脏细菌计数差异. 结果 成功构建重组株E.coli BL21(DE3)/pET32a-R049 ORF,重组蛋白相对分子质量(M,)约为66.9×103,纯化后其纯度达到95%,制备多克隆抗体效价为≥l:102 400.Western blot证实重组R049蛋白与UPECl32全菌蛋白均能与小鼠抗血清发生特异性反应.动物实验结果表明尿液和肾脏菌落计数在免疫组均明显低于对照组(P
关键词： 致肾盂肾炎大肠埃希菌 R049基因 克隆表达 免疫保护 动物实验
