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EV71毒力相关位点研究进展
肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)是引起手足口病(hand-foot-and-mouth disease,HFMD)的主要病原体之一,主要通过粪口途径以及与患者的病变部位、唾液等直接接触而感染,感染对象主要为5岁以下的低龄儿童.其所引起的临床症状以温和的HFMD为主,表现为手、足及口腔黏膜的疱疹样病变,多数可自愈,但在少数病人中则可引起包括无菌性脑膜炎(aseptic meningitis)、脑干脑炎(brainstem encephalitis)、类脊髓灰质炎麻痹(poliomyelitis-like paralysis)等神经系统综合症及心-肺功能衰竭综合症在内的严重的临床症状.
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肠道病毒71型3D聚合酶转录激活域的界定
EV71是导致手足口病的主要病原体之一,其3D聚合酶作为依赖于RNA的RNA聚合酶,在病毒基因组转录及复制过程中发挥重要作用.当前,3D与宿主细胞的相互作用鲜有研究.酵母双杂交实验是研究蛋白质相互作用成熟有效的方法.本文将3D基因克隆至pGBKT7载体,构建了用于酵母双杂交实验的诱饵质粒,鉴定正确后转化酵母细胞AH109,依次检测了3D蛋白的表达、细胞毒性和自激活能力,结果表明3D基因可在AH109菌株中表达,对后者生长无显著影响,但融合蛋白具有自激活能力.进一步构建一系列含3D蛋白截短体的诱饵质粒,通过自激活实验界定了3D的小转录激活域(1～94 aa),为后续利用酵母双杂交技术研究与3D相互作用的细胞蛋白奠定了基础.
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柯萨奇病毒B3型3D蛋白抗体的制备
肠道病毒3D蛋白是其RNA聚合酶.柯萨奇病毒B3型(coxsackievirus B3,CVB3)主要感染心脏,其3D蛋白在心肌表达中的时序和分布尚不清楚.本研究将通过聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)获得的CVB 3D片段插入pET28a(+)的表达框,获得pET28a(+)-3D重组质粒.异丙基 β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导pET28a(+)-3D表达3D-His蛋白,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)后,切胶,获得3D-His蛋白.3D-His蛋白加佐剂免疫新西兰大白兔制备3D蛋白多克隆抗体,蛋白免疫印迹法检测抗体效价及特异性.结果显示,本研究获得了高效价且特异性好的抗CVB3 3D蛋白抗体,可用于CVB3 3D蛋白功能的后续研究.
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口蹄疫病毒3D聚合酶多克隆抗体的制备与特性分析
目的 表达口蹄疫病毒3D聚合酶,并制备兔抗3D多克隆抗体.方法 采用PCR方法扩增口蹄疫病毒(FMDV)3D聚合酶基因,经BamHⅠ和NdeⅠ双酶切后插入pET-30a(+)原核表达载体,构建的pET-3D重组表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE鉴定目的蛋白的表达并提取包涵体,纯化目的蛋白.然后用纯化蛋白免疫新西兰大耳白兔制备多克隆抗体,以Western blot鉴定抗体特异性,并以间接ELISA方法测定其效价.结果 SDS-PAGE电泳分析显示,表达的目的蛋白约为46ku,与预期结果相符,制备的多克隆抗体效价达1:8000以上,且具有较高的特异性.结论 制备了具有高亲和性和特异性的3D聚合酶多克隆抗体,为3D聚合酶的生物学功能和抗原表位研究奠定了基础.
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串联亲和纯化技术筛选肠病毒71型3D聚合酶的相互作用蛋白
目的 利用串联亲和纯化技术筛选与肠病毒71型3D聚合酶相互作用的宿主细胞蛋白.方法 利用RT-PCR方法从EV71BrCr株全基因组中获得3D聚合酶全长基因,构建pcDNA3.0-3D-Flag-HA真核表达载体并转染RD细胞,48 h后收集细胞.用Western blot方法检测3D蛋白在RD细胞内的表达情况.串联亲和纯化技术筛选与3D聚合酶相互作用的宿主蛋白并进行质谱分析,确定与3D聚合酶相互作用的蛋白或多肽.并采用免疫共沉淀实验,对候选蛋白CyclinG1与3D的相互作用进行验证.结果 成功构建了pcDNA3.0-3D-Flag-HA载体,在RD细胞内检测到3D蛋白的表达.经串联亲和纯化和质谱分析得到LATS2、Nek2、APC5、CyclinG1、PI3K等一系列参与细胞凋亡及细胞周期调控的蛋白.免疫共沉淀实验证实3D蛋白与CyclinG1的相互作用.结论 3D聚合酶可能与宿主细胞内蛋白相互作用,引起细胞凋亡及细胞周期改变.
关键词： 肠道病毒71型 3D聚合酶 串联亲和纯化 液相色谱-质谱分析法
