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EV71 3C蛋白酶对肿瘤坏死因子受体相关因子3(TRAF3)的切割作用研究
目的 探讨肠道病毒71型(EV71)编码的3C蛋白酶对于肿瘤坏死因子受体相关因子3(TRAF3)的切割作用.方法 采用Western blot的方法检测EV71感染对于TRAF3蛋白表达的影响.体外转染TRAF3和3C蛋白,通过Western blot检测3C对于TRAF3蛋白的影响.通过构建3C突变体,检测其蛋白酶活性对于切割的影响.通过免疫共沉淀检测3C对于TRAF3和TRIF相互作用 的影响.结果 EV71感染细胞后可引起TRAF3蛋白的减少,其3C蛋白酶可以引起TRAF3的切割,蛋白酶活性位点突变后则不引起TRAF3的切割.位点突变试验显示TRAF3的Q242位突变后则不能被3C切割,且3C可以减少TRAF3与TRIF的结合.结论 EV71 3C蛋白酶可通过切割TRAF3机制在天然免疫逃逸中发挥作用.
关键词： 肠道病毒71型 肿瘤坏死因子受体相关因子3 3C蛋白酶 天然免疫 -
EV71毒力相关位点研究进展
肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)是引起手足口病(hand-foot-and-mouth disease,HFMD)的主要病原体之一,主要通过粪口途径以及与患者的病变部位、唾液等直接接触而感染,感染对象主要为5岁以下的低龄儿童.其所引起的临床症状以温和的HFMD为主,表现为手、足及口腔黏膜的疱疹样病变,多数可自愈,但在少数病人中则可引起包括无菌性脑膜炎(aseptic meningitis)、脑干脑炎(brainstem encephalitis)、类脊髓灰质炎麻痹(poliomyelitis-like paralysis)等神经系统综合症及心-肺功能衰竭综合症在内的严重的临床症状.
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肠道病毒71型3C蛋白酶在大肠杆菌中的表达及活性研究
本研究利用大肠杆菌表达系统构建肠道病毒71型3C蛋白酶,并进行纯化,对其酶活性进行研究.首先,将3C蛋白酶基因克隆至pET28a载体,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,Ni-NTA柱亲和层析纯化获得3C蛋白酶,经肠激酶酶切去除N端His标签后获得无His标签的3C蛋白酶,再以荧光多肽为底物进行酶活性研究.经过双酶切鉴定和测序证实,重组表达质粒pET28a 3C构建正确,表达的重组3C蛋白酶相对分子质量约22kD；纯化后有无His标签的3C蛋白酶均能催化荧光底物3B-3C,并且两者的酶动力学数据无显著差异,含有His标签的3C蛋白酶Km、Vmax、Kcat分别为22μM、434nM.Min-1、0.0669 Min-1；其适反应pH为7.0,佳反应温度为30℃～37℃.本实验成功表达并纯化了重组3C蛋白酶,该酶具有良好的活力,为抗病毒抑制剂、结构蛋白组装、疫苗开发及3C蛋白酶检测方法的研发奠定了基础.
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肠道病毒A71型3C蛋白结构、功能及抗3C蛋白药物的研究进展
肠道病毒A71型(Enterovirus A71,EV-A71)可引起手足口病(Hand,foot,and mouth disease,HFMD),严重者伴有神经系统并发症,如无菌性脑膜炎、神经源性肺水肿等.EV-A71引起的HFMD自2007年以来在全世界,尤其是亚太地区多次暴发,已成为亚太地区公共健康的主要威胁之一.目前尚无有效的抗病毒药物或疫苗.EV-A71的致病机制尚未完全研究清楚,而非结构蛋白3C在病毒的复制和抑制天然免疫方面发挥了不可替代的作用.EV-A71 3C蛋白的研究在进一步了解EV-A71的致病机制以及研制抗病毒药物方面发挥着重要的作用.本文将对EV-A71 3C蛋白的结构、功能以及抗3C蛋白病毒药物的研究进展做出综述.
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小RNA病毒3C蛋白酶研究进展
小RNA病毒科病毒包括数目众多的小RNA病毒,其中很多小RNA病毒是人畜重要的病原体.不同种属的小RNA病毒的3C蛋白酶具有典型的G-X-C-G基序和Cys-His-Asp/Glu催化中心;小RNA病毒3Cpro完成P1区VP2～VP3、VP3～VP1;P2区的2A～2B、2B～2C以及整个P3区成熟剪切;小RNA病毒多聚前体蛋白3Cpro成熟剪切分析显示,3Cpro作用底物具有明显的Q-G/S/A/V/H/R和E-S/G/R/M喜好性及种属特异性;固有免疫应答重要配体分子TRIF、MAVS、IRF3、IRF7和NEMO的3Cpro酶切位点预测显示,不同配体分子具有数目各异的可能酶切位点,其中TRIF和NEMO的3Cpro可能作用位点具有多样性.上述问题的探究,为基于小RNA病毒3Cpro的广谱抗病毒药物研制和小RNA病毒免疫逃逸机制提供资料.
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EV71 3C蛋白酶表达纯化、活性分析及与抑制剂模拟对接研究
目的 表达和纯化肠道病毒71型(EV71)3C蛋白酶并通过与抑制剂相互作用预测其活性位点. 方法 将3C蛋白酶片段克隆至Pet-28a原核表达载体,重组质粒导人大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,获得3C蛋白酶融合蛋白,经Ni-NTA柱亲和纯化后以荧光多肽为底物检测3C蛋白酶的活性.使用AutoDock模拟3C蛋白酶与芦丁(Rutin)和芦平曲韦(Lupintrivir)对接. 结果 经酶切、PCR、测序证明pET28a-3C重组质粒构建成功,表达产物分子质量约23×103,纯化的3C蛋白酶酶活较好;对接结果表明Rutin和Rupintrivir通过形成氢键网和疏水键与3C蛋白酶底物结合位点结合,结合的活性氨基酸残基有His161、Gly163、Gly164、Phe170. 结论 成功制备了具有生物学活性的高纯度EV71 3C蛋白酶,建立了预测能力较好的对接模型,为以3C蛋白酶为靶点的药物设计和筛选奠定了基础.
关键词： 肠道病毒71型(EV71) 3C蛋白酶 蛋白纯化 酶活检测 分子对接 -
3C和3CL蛋白酶及广谱抑制剂的研究进展
小RNA病毒和冠状病毒属于单正链RNA病毒，其家族中的病原体易导致手足口病、心肌炎、普通感冒以及严重的呼吸道和肠道疾病。3C和3CL蛋白酶都属于半胱氨酸蛋白酶，底物结合位点高度保守且具有相似的催化机制，是催化单正链RNA病毒前体蛋白裂解的关键蛋白酶，对病毒的复制有重要作用。人体中没有与其相似的蛋白酶，是目前广谱抗单正链RNA病毒研究的重要靶点。利用3C和3CL蛋白酶结构的相同点，成功发现了具有广谱作用的蛋白酶抑制剂。本文简要概述3C和3CL蛋白酶的结构、功能和广谱抑制剂的研究进展，并简要阐释抑制剂的作用机制，对该类酶的广谱抑制剂研究和相关病毒的治疗具有指导意义。
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新型抗EV71病毒3 C蛋白酶抑制药的设计、合成及其活性
目的:寻找抗EV71病毒新化合物. 方法:采用分子模拟技术,以EV71病毒3C蛋白酶活性口袋为靶,设计二肽、三肽,四肽,五肽和六肽等多个系列寡肽化合物,合成对接评分较高的寡肽化合物并进行抗EV71病毒活性筛选. 结果: 五肽对接评分高于其他系列寡肽,显示五肽化合物与EV71 病毒3C蛋白酶有更强的键合力. 研究中合成了两个评分较高的五肽化合物25和化合物16,体外抗EV71病毒活性实验显示化合物25活性较强(EC50 =1. 36 μmol·L-1,CC50 =211. 94 μmol·L-1, SI=155. 84),而化合物16则无明显活性. 结论:五肽化合物25可作为抗EV71病毒新骨架开展进一步研究.
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基于虚拟筛选的热毒宁抗HRV 3C蛋白酶抑制剂作用的研究
目的:运用虚拟筛选技术从热毒宁注射液中筛选出抗鼻病毒3C蛋白酶的有效中药小分子抑制剂.方法:以热毒宁注射液中460种化合物为筛选目标,选取2个目前与鼻病毒治疗密切相关的靶点蛋白为受体,采用SYBYL分子对接的方法,以TotalScore结合打分为标准筛选出得分高的分子并观察其结合模式图,借助DiscoveryStudio2016软件对其进行相互作用的分析,预测其结合模式及亲和力.结果:通过分子对接方法,筛选出5个符合条件(以打分函数Total-Score 6分以上为阈值,以Total-Score 9分以上为较好活性)且与靶点蛋白结合好的中药小分子.其中,有2个小分子Total-Score打分高,即与5FX5、5FX6蛋白活性位点的匹配度高,并均超过其与自身配体结合打分,分别为似梨木双黄酮、绿原酸.结论:热毒宁注射液化学成分与鼻病毒3C蛋白酶相关靶点具有一定的结合和抑制效应.该结果可促进从传统中药中提取、设计以及实验合成新的抗鼻病毒药物.
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含3C蛋白酶切位点的人CD226胞膜外区Ig融合蛋白的真核表达及应用
目的: 构建含3C蛋白酶酶切位点的人CD226(PTA1)分子胞膜外区Ig融合蛋白编码基因的真核表达载体,并进行表达和初步鉴定. 方法: 将人CD226分子的胞膜外区基因, 克隆入含3C蛋白酶靶序列的Ig真核表达载体p-3C-Ig中.测序证实后, 转染COS7细胞并进行瞬时表达.表达产物经亲和层析柱纯化, 并通过免疫荧光染色及3C蛋白酶酶切反应进行鉴定. 结果: 经表达和纯化获得CD226胞膜外区的Ig融合蛋白. 该融合蛋白可与表达于ECV304细胞表面的CD226配体有效结合.同时, 融合蛋白的Fc段亦经3C蛋白酶切除, 从而获得CD226胞膜外区的真核表达分子.结论: 成功地获得了含有3C蛋白酶酶切位点的人CD226分子胞膜外区Ig真核表达产物, 为进一步对CD226分子进行结构和功能研究, 以及X线结晶衍射提供了重要条件.
关键词： CD226(PTA1) 真核表达 融合蛋白 3C蛋白酶
