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人DRR1真核表达载体和稳定转染HEK293细胞株的建立及鉴定
目的:构建人DRR1基因的真核表达载体,通过转染HEK293细胞建立稳定的DRR1表达细胞株.方法:通过改造质粒pIRES,在其MCS1和MCS2中分别引入串联亲和纯化标签和绿色荧光蛋白基因,形成一个新的表达质粒pFSIG.将PCR扩增的DRRl1基因插入pFSIG中进行酶切和测序验证.用重组质粒pFSIG-DRR1转染HEK293细胞,通过G418和绿色荧光检测筛选DRR1稳定表达细胞株.通过Westernblot鉴定FS-DRR1蛋白的表达.结果:酶切、PCR和测序证实成功构建了pFSIG-DRR1表达质粒；建立了稳定转染的HEK293细胞系,Western blot检测证明重组DRR1在该细胞系中成功表达.结论:融合有串联亲和纯化标签的DRR1真核表达载体的构建和稳定表达细胞HEK293株的建立为在生理条件下研究DRR1的相互作用蛋白奠定了基础.
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带TAP标签的癌蛋白SET真核载体的构建及其表达
背景与目的:为研究三氯乙烯诱导的差异蛋白SET在肝细胞L-02中的相互作用,构建带串联亲和纯化(tandem affinitypurification,TAP)标签融合表达的真核表达载体pcDNA3.1/SET-TAP.材料与方法:从L-02肝细胞中提取总RNA,采用RT-PCR法扩增SET基因,从质粒中扩增得到TAP基因,采用重叠PCR法将基因SET与TAP连接成SET-TAP,双酶切后纯化序列定向克隆至pcDNA3.1/zeo(+)并转化E.coli DH 5α,取阳性克隆进行酶切和测序鉴定,重组质粒瞬时转染L-02肝细胞进行表达,Real Time-PCR和Westem blotting检测融合蛋白的表达.结果:经双酶切和DNA测序鉴定,证实pcDNA3.1/SET-TAP真核表达载体构建成功,将该载体转染L-02细胞后,融合蛋白在肝细胞中获得高效表达.结论:该结果为研究SET在三氯乙烯致肝细胞毒性的蛋白质相互作用以及三氯乙烯致机体损伤的机制奠定了基础.
