首页 > 文献资料
-
人肺癌组织中NLK与TCF4的表达及临床意义
目的:NLK(Nemo-like kinase)是一种MAPK样激酶,与多种肿瘤的发生发展有关.本研究目的是探讨NLK在人肺癌中的表达与TCF4表达的相关性,及其与肺癌临床病理因素的相关性.方法:采用免疫组织化学方法检测NLK和TCF4在120例人肺鳞癌和腺癌组织及癌旁正常肺组织中的表达情况.结果:NLK表达定位于细胞核.NLK在人肺癌组织中的表达显著高于癌旁正常肺组织(P<0.01).NLK在人肺鳞癌组织中的表达显著高于腺癌组织(P=0.016),但与人肺癌组织的分化程度、TNM分期、淋巴结转移及患者的年龄和性别无明显相关性.TCF4在人肺癌组织中的表达也显著高于癌旁正常肺组织,并与肺癌的高TNM分期相关(P=0.005),但与人肺癌组织的分型、分化程度、淋巴结转移及患者的年龄和性别无明显相关性.NLK在人肺癌组织中的表达与TCF4的表达显著负相关(r=-0.322,P<0.01).结论:NLK在人肺癌组织中高表达,并定位于细胞核,NLK的高表达与人肺癌的组织学类型相关,并与TCF4的表达负相关.
关键词： NLK TCF4 肺癌 Wnt/β-catenin信号通路 人 -
NLK以激酶非依赖的方式抑制Smad4的转录活性
目的：验证Nemo样激酶（ NLK）与Smad4之间的相互作用并探讨NLK对Smad4功能的影响。方法应用免疫共沉淀和谷胱甘肽硫基转移酶（ GST）沉降技术检测NLK与Smad4之间相互作用，GST沉降技术确定Smad4与NLK相互作用的结构域，荧光素酶报告基因实验检测NLK及NLK激酶活性突变体-NLK（ KM）对Smad4转录活性的影响，体内磷酸化实验检测NLK对Smad4磷酸化的影响。结果免疫共沉淀和GST沉降的结果显示，NLK与Smad4在体内和体外存在相互作用。 GST沉降的结果显示Smad4通过MH2结构域与NLK结合。荧光素酶报告基因实验的结果显示，NLK和NLK（ KM）均可抑制Smad4的转录活性，且抑制程度相同。体内磷酸化的结果显示， NLK不能磷酸化Smad4。结论 NLK与Smad4相互作用，以激酶非依赖的方式抑制Smad4的转录活性，NLK抑制Smad4的分子机制有待进一步探讨。
-
利用串联亲和纯化结合质谱分析分离和鉴定与蛋白激酶NLK结合的蛋白复合物组分
目的 利用串联亲和纯化结合质谱分析分离和鉴定与蛋白激酶NLK结合的蛋白复合物组分.方法 将RFP、NLK和其突变体NLKK155M克隆至本室改造的带有Flag和Strep双标签的反转录病毒载体pMSCVpuro中,通过酶切鉴定并测序验证其构建的正确性.采用反转录病毒感染结合嘌呤霉素筛选的方法,获得稳定表达RFP、NLK、NLK突变体NLKK155M的HCT-116细胞株,Western blot法检测目的蛋白RFP、NLK和NLKK155M的表达.采用串联亲和纯化结合质谱分析,分离、鉴定与NLK结合的蛋白.结果 构建的pMSCVpuro/N-Flag-Strep-RFP和pMSCVpuro/N-Flag-Strep-NLK质粒经酶切鉴定、测序证明质粒构建正确,pMSCVpuro/N-Flag-Strep-NLK155M质粒经测序证明构建正确.携带上述基因的反转录病毒感染的HCT-116细胞,Flag-Strep-RFP、Flag-Strep-NLK和Flag-Strep-NLKK155M均正常表达.经串联亲和纯化和质谱分析,发现多个可能与NLK结合的蛋白.结论 本研究采用串联亲和纯化结合质谱分析成功鉴定了若干可能与NLK及其突变体NLKK155M结合的蛋白质.
-
Nemo-like kinase(NLK)在胶质瘤细胞U87MG凋亡中作用的研究
目的 探讨Nemo-like kinase(NLK)在胶质瘤细胞U87MG凋亡中的作用.方法 建立NLK的过表达和小干扰质粒干扰NLK在胶质瘤细胞株U87MG中的表达.CCK-8和细胞免疫印迹的方法检测NLK和胶质瘤细胞U87MG凋亡指标caspase-3的关系.结果 构建的过表达和小干扰质粒能明显地影响NLK的表达.CCK-8和细胞免疫印迹的结果显示NLK能够诱导胶质瘤细胞U87MG的凋亡.结论 NLK能够通过激活经典的凋亡途径而诱导胶质瘤细胞U87MG的凋亡.
-
miR-375通过靶向NLK影响鼻咽癌的增殖及迁移
目的 探讨miR-375在鼻咽癌患者中表达的临床意义及其对鼻咽癌细胞的影响.方法 收集67例鼻咽癌组织标本和53例慢性鼻咽炎症组织标本,采用qRT-PCR检测组织标本和鼻咽癌细胞株CNE1、CNE2、C666-1及人永生化鼻咽上皮细胞株(NP69)中miR-375的表达水平;分别转染miR-375的模拟物或抑制物,CCK8法检测细胞的增殖,Transwell实验检测细胞的迁移;生物信息学靶基因预测miR-375的靶基因,并经双荧光素酶及蛋白质印迹法(Western blotting)验证靶基因.结果 鼻咽癌组织中miR-375表达水平与慢性鼻咽炎症组织相比明显下调(P＜0.05);miR-375的表达水平与患者的临床分期、区域淋巴结受累情况以及肿瘤大小有关(P＜0.05),但与患者年龄、性别、吸烟史、分化程度及组织类型无关(P＞0.05);鼻咽癌细胞与NP69相比较,miR-375的表达水平均显著低于NP69(P ＜0.05);miR-375过表达后C666-1细胞增殖、迁移显著低于慢性鼻咽炎-模拟物组(P＜0.05),Nemo样激酶(Nemo-like kinase,NLK)的表达下调.miR-375抑制后CNE1细胞增殖、迁移显著高于慢性鼻咽炎-抑制物组(P＜0.05),miR-375对NLK具有直接靶向调控作用.结论 miR-375在鼻咽癌中呈低表达,并与患者的临床分期、区域淋巴结受累情况以及肿瘤大小有关,其可能是通过下调靶基因NLK,从而抑制鼻咽癌的增殖及迁移.
-
LiCl 对胰岛 NIT －1细胞 NLK 和 FOXO1表达的影响
目的：观察在不同葡萄糖浓度条件下，LiCl对胰岛β细胞株NIT－1细胞NLK和FOXO1基因表达的影响，探讨NLK与FOXO1基因表达对胰岛β细胞增殖周期和胰岛素分泌的影响。方法在含不同浓度（5.6、11.1、16.7、27.6 mmol／L）葡萄糖的培养基培养NIT－1细胞，应用10 mmol／L的LiCl干预48 h， MTT法检测NIT－1细胞增殖情况；放射免疫法测定NIT－1细胞胰岛素分泌水平，免疫印迹法检测细胞内NLK和FOXO1蛋白表达，流式细胞术法检测细胞周期变化。结果 LiCl 能够增加IT－1细胞增殖率，干预组与于无药干预对照组比较差异有统计学意义（ P＜0.05）；干预组的NIT－1细胞胰岛素分泌水平明显增高，细胞内NLK蛋白表达明显升高，而FOXO1蛋白表达明显降低，此时该组的G1／G0期细胞百分比明显降低，S期与G2／M期细胞百分比之和明显增加，细胞增殖指数也明显升高，与对照组比较差异均有统计学意义。结论 LiCl可能通过调控NLK基因抑制FOXO1基因表达和促进NIT－1细胞增殖和胰岛素分泌。
-
NLK 通过Smad4负调控 TGFβ信号通路
目的：探讨NLK对转化生长因子β（TGFβ）信号通路的影响及其分子机制。方法采用蛋白质稳定性实验检测NLK对Smad4蛋白质降解的影响；体内泛素化实验检测过表达NLK对Smad4泛素化修饰的影响；荧光素酶报告基因实验检测NLK对TGFβ信号通路报告基因载体CAGA‐luc和3TP‐luc的影响；实时定量PCR技术检测NLK对TGFβ信号通路靶基因p21和PAI‐1的影响。结果在 HEK293T细胞内，过表达NLK促进Smad4的降解和泛素化修饰；在HEK293T细胞内过表达NLK抑制细胞因子 TGFβ对CAGA‐luc和3TP‐luc的激活作用；在 HepG2细胞内过表达 NLK 抑制 TGFβ信号通路靶基因p21和PAI‐1的表达。结论 NLK促进Smad4的泛素化修饰和降解，进而抑制TGFβ信号通路。
