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重组蛋白质亲和标签的选择与串联亲和纯化的应用进展
重组蛋白质技术作为蛋白质研究的重要手段之一,在生物化学与生物物理学研究领域,扮演着极其重要的角色.亲和纯化作为为方便与快捷的重组蛋白质纯化手段,日益得到广泛的应用.由于各种亲和标签,纯化介质层出不穷,性质各异.应根据自身研究对象具体情况选择合适的亲和纯化标签.近年双亲和标签进行串联亲和纯化日益成为蛋白质相互作用研究的重要方法.多种亲和标签的搭配已得到成功应用,部分已进入商业化,并在各种模式生物中得到广泛的应用,本文就重组蛋白质亲和标签的选择与串联亲和纯化作一综述.
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细胞穿透肽 CCL 融合蛋白的构建与表达
目的：评估细胞穿透肽 CCL 融合蛋白构建的可能性。方法将 CCL6-PEP-6XHis 构建至 pABP 质粒，然后提取 pABP-CCL6-PEP 质粒进行人胚肾 HEK293细胞转染表达，以及 CCL6-PEP-6XHis 蛋白层析纯化和检测。结果成功构建并纯化细胞穿透肽 CCL 融合蛋白。将 CCL6-PEP-6XHis Tag 基因经 PCR 扩增、接入 T 载体、克隆、培养，并提取质粒进行测序鉴定，所得序列与目的基因一致。成功将 CCL6-PEP-6XHis 基因构建至哺乳动物细胞表达载体 pABP 中，经质粒提取和酶切鉴定，电泳结果显示，HindⅢ＋ XbaⅠ切出约430 bp 的条带，符合预期，酶切鉴定正确。蛋白质印迹法（Western Blot）检测结果阳性，表明纯化得到的目标蛋白带有 hisx6标签。结论细胞穿透肽 CCL 融合蛋白能够人工构建，并通过真核细胞进行表达。
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重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白对类风湿关节炎患者自身抗体的影响
目的:了解重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体一抗体融合蛋白(益赛普)对类风湿关节炎(RA)患者血清自身抗体的影响.方法:选取24例处于活动期的RA患者,年龄28～56岁,其中女19例,男5例,病程0.5～3年.益赛普25 mg皮下注射,每周2次,共治疗12周.在益赛普治疗前、后抽取患者血清,分别检测血清中类风湿因子(RF)、抗核抗体(ANA)、抗ENA抗体、抗双链DNA(ds-DNA)抗体、抗组蛋白抗体、抗心磷脂抗体(aCL)、抗中性粒细胞胞浆抗体(ANCA)等自身抗体.结果:益赛普治疗12周后,RF水平较治疗前明显下降(P<0.01);治疗后ANA、抗dsDNA抗体及抗组蛋白抗体阳性率较治疗前明显升高(P<0.05);而治疗前、后抗ENA抗体、aCL、ANCA的阳性率变化无显著性.24例RA患者中无一例出现系统性红斑狼疮样综合征.结论:RA患者使用益赛普治疗后可以出现自身抗体的变化.但没有发现患者出现系统性红虎狼疮样综合征.
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TAT/CT-1及TAT/EGFP融合蛋白的表达与纯化及其在小鼠体内分布的观察
目的分别构建含蛋白转导域(protein transduction domain,PTD)TAT与小鼠心肌营养素-1(CT-1)及TAT与增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)融合基因片断的原核表达质粒TAT/CT-1及TAT/EGFP,利用大肠杆菌进行表达并纯化;观察融合蛋白在小鼠体内的分布.方法采用PCR及克隆技术将CT-1编码区基因以及EGFP基因分别与TAT连接到原核表达载体pGEX-4T3上.用IPTG诱导表达融合蛋白,谷胱甘肽琼脂糖4B纯化融合蛋白.小鼠尾静脉注射融合蛋白,脑、脊髓、肝、心肌等器官冰冻切片,免疫荧光观察融合蛋白的存在.结果目的片断CT-1及EGFP被有效的扩增,构建后质粒测序表明无PCR引起的突变,TAT/CT-1及TAT/EGFP在转化的大肠杆菌中获得高效表达,并成功纯化.脑、脊髓、肝、心肌等组织切片免疫荧光检测呈阳性.结论成功获得了有活性的TAT/CT-1及TAT/EGFP的基因表达产物;TAT可介导CT-1及EGFP由细胞外跨膜转导进入细胞内;为CT-1功能的进一步研究打下了基础.
