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双向凝胶电泳在临床血浆蛋白质组学研究中的技术难点和解决方法
随着双向电泳技术中固相化pH梯度的发明、电喷雾质谱、基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术的应用,蛋白质组学技术已经越来越多的应用于疾病的研究中.临床蛋白质组学已经成为目前医学研究中的热点[1].血液标本因取材简便、应用价值高,因此血浆蛋白质组学具有应用前景,并成为临床蛋白质组学研究中关注的重要问题.
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血管紧张素转换酶固相化方法的选择
分别采用琼脂包埋法、卵清包埋法、海藻酸钙包埋法、明胶-戊二醛包埋法、溴化氰活化连接法和苯甲磺酰氯结合方法对血管紧张素转换酶进行固相化研究,发现苯甲磺酰氯结合法用于血管紧张素转换酶固相化效果好.此实验是在低水活度条件下,利用苯甲磺酰氯在丙酮和吡啶存在的条件下活化Sepharose CL-4B凝胶侧链基团上的羟基,形成具有高反应活性的苯甲磺酰基团,在pH7.8的0.2mol/L HEPES-HCl缓冲系统中,4℃反应12h,将酶与凝胶连接在一起.25mg ACE与5g活化琼脂糖凝胶在这种条件下反应,所得固相酶活力为10.86U/mg,蛋白固相率达到66%,酶活力固相率为53.3%.固相酶4℃保存3个月,活力剩余80%,20℃保存1个月酶活残留61%.同样条件下,溶液酶活力分别只剩余62%和19%,由此可见血管紧张素转换酶经固相化后稳定性明显提高.
关键词: 血管紧张素转换酶 Sepharose CL-4B 苯甲磺酰氯 固相化 -
三种不同固相化方法用于抗环瓜氨酸肽抗体测定的研究
类风湿关节炎(RA)是一种病因未明的慢性炎性自身免疫疾病,该病以多关节滑膜炎为主要特征.自schellekens等合成环瓜氨酸肽(CCP)并用于抗CCP抗体检测后,其已成为RA早期诊断的有效指标[1-4].
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血小板特异性抗体测定与儿童特发性血小板减少性紫癜的关系
特发性血小板减少性紫癜(ITP)发生的主要原因是抗血小板自身抗体引起的血小板破坏,因而血小板自身抗体的检测对ITP的诊断及发病机理的研究有重要价值.本研究用改良的血小板抗原单抗特异性固相化法(monoclonal antibody specific immobolization of platelet antigens, MAIPA)测定了ITP患儿和非免疫性血小板减少症患儿血清中的抗GPIIb/IIIa和抗GPIb/Ix自身抗体,并同时测定这些患儿的血小板表面相关抗体(PAIgG)作为比较,以试图评价血小板膜糖蛋白特异性抗体测定在ITP患儿中的诊断价值.
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ELISA检测抗HCV影响因素分析
ELISA方法的检测原理是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记.结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性,酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性,又保留酶的活性.在测定时,受检标本(测定其中的抗体或抗原)与固相载体表面的抗原或抗体起反应.用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开.
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固相化细胞吸附浓集法分离污水中脊髓灰质炎病毒的实验研究
[目的]建立一个适用于污水中脊髓灰质炎病毒分离培养的方法.[方法]采用固相化的L20B细胞吸附法,浓集污水中的脊髓灰质炎病毒,将浓集物再用活的L20B细胞培养.[结果]能够检出1000ml水中的0.1~10TCID50量的脊髓灰质炎病毒,在1000ml预处理后的污水中加入10TCID50量的病毒,亦可以检出.[结论]本方法的有效检出限为10TCID50/1000ml,可用于污水中的脊髓灰质炎病毒的浓集和分离培养.
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血液中血小板与白细胞抗体的固相化筛查
目的:使用固相化方法检测输血患者体内针对血小板、淋巴细胞与粒细胞抗体的产生情况.方法:收集丽水地区597例输血患者输血前后的血样,使用固相化抗体筛查技术对患者血样进行筛查,分析患者输血之后,体内针对血小板、淋巴细胞与粒细胞的抗体产生频率.结果:使用固相化抗体筛选体系对待检样本进行筛查之后,检出输血前血小板抗体72例(12.06%),淋巴细胞抗体103例(17.25%),粒细胞抗体108例(18.09%),混合抗体(包括同时存在2种或3种抗体)48例(8.04%),输血后血小板抗体102例(17.09%),淋巴细胞抗体105例(17.59%),粒细胞抗体115例(19.26%),混合抗体74例(12.40%).结论:患者输血后针对血小板和白细胞抗原的抗体产生频率会增加,使用固相化抗体筛查体系可以进行高通量血液抗体筛查.经过抗体筛查可以提高输血安全性.
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影响ELISA检测HBsAg错误结果的分析
目前国内临床多采用 ELISA双抗体夹心法检测乙型肝炎表面抗原 (HBsAg),其基本原理:将包抗体被在载体后作固相抗体,加入代测标本,使其中的相应抗原通过免疫学反应结合到固相抗体上,洗去未结合的抗原;加入酶结合物与结合在固相抗体的抗原反应,洗去未结合的游离结合物;加入酶(常用辣根过氧化物酶)的相应底物,固相化的酶催化底物反应生成有色反应.
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红细胞RhD膜蛋白提取与固相化方法的研究
目的 提取红细胞RhD膜蛋白并将其固化至乳胶微球以获得固相化RhD蛋白靶分子.方法 采集3份志愿者全血标本,分别使用Yared MA法提取浓缩红细胞、试剂盒法提取浓缩红细胞及血影细胞膜蛋白的方法提取标本红细胞RhD膜蛋白,通过蛋白质定量检测及免疫印迹试验评价不同方法的提取效果.将不同方法提取出的RhD蛋白固化至乳胶微球,并通过流式细胞仪分析其抗原活性.结果 RhD膜蛋白浓度(mg/mL)分别为(n=3):0.24±0.04(Yared MA法提取浓缩红细胞)、4.82±0.09(试剂盒法提取浓缩红细胞)和4.31±0.39(试剂盒法提取血影细胞)与浓缩红细胞上的RhD膜蛋白浓度(mg/mL).免疫印迹试验:Yared MA法从浓缩红细胞提取的RhD蛋白仅有1条RhD特异性条带;试剂盒法从浓缩红细胞提取的RhD蛋白无特异性条带,从血影细胞提取的RhD蛋白有2条RhD特异性条带.流式分析(n=3):Yared MA法提取的浓缩红细胞样品与试剂盒法提取的血影细胞样品、浓缩红细胞样品的荧光强度分别为:98.00±12.53、92.67±10.69、50.00±13.89.结论 Yared MA法提取出的RhD膜蛋白固化于乳胶微球可获得RhD蛋白纯度及抗原性较佳的固相靶分子.
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固相化HEK细胞在无血清培养基中高效表达重组人活性蛋白C
研究固相化HEK工程细胞的培养和产生rhAPC的水平.先将HEK细胞由贴壁适应为无血清悬浮培养,再用海藻酸钙固定,并在无血清培养基中悬浮培养(高约为27mg/L).固相细胞动态培养的表达水平高于细胞静态悬浮培养的表达水平(高约为50mg/L).固相细胞动态培养可实现细胞的高密度培养,得到较高的表达水平.