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两种CpG基序能高度活化人免疫细胞
目的筛选活化人免疫细胞的CpG基序(CpG motif),设计对人免疫细胞有强免疫刺激活性的CpG寡脱氧核苷酸(CpG-ODN). 方法设计合成含有5′-CG-3′二核苷酸、长度为12个碱基的硫代修饰CpG-ODN,并利用体外培养的人外周血单个核细胞(PBMC),以培养上清中的IgM水平为指标,筛选能够活化人免疫细胞的CpG基序.根据筛选获得的活性CpG基序,设计一组含有2～6拷贝CpG基序、长度为15～30个碱基的CpG-ODN,从中筛选对人免疫细胞有强免疫刺激活性的序列. 结果发现了多个活性CpG基序,其中5′-GACGTT-3′,5′-GACGTC-3′,5′-GGCGTT-3′和5′-GGCGTC-3′等4个基序对人B细胞有中度免疫刺激活性,和已发表的小鼠CpG基序完全一致;5′-GTCGTT-3′和5′-GTCGTC-3′ 2个基序对人B细胞有高度免疫刺激活性,第二位碱基均为“T”,而在小鼠CpG基序中该位碱基为“G”或“A”.根据后2个CpG基序,设计了多个对人免疫细胞有高度免疫刺激活性的CpG-ODN. 结论人免疫细胞中存在有高度免疫刺激活性的CpG基序和CpG-ODN.
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新型乙肝疫苗CpG-BW006佐剂对鼠脾B细胞表型和功能的影响
乙型肝炎病毒(HBV)感染是慢性肝炎、肝硬化和原发性肝癌的重要原因,目前尚无治疗HBV感染的特效方法.乙肝疫苗是预防HBV感染安全、有效的手段.然而,接种乙肝疫苗后的免疫应答受多种因素的影响,约有10％的人群对该疫苗反应低下或无反应[1].CpG为近年来佐剂研究的热点.由于CpG-ODN具有同时提高细胞免疫和体液免疫的特点,在体内主要诱导Th1型免疫应答,因此被认为是一种有潜力的新型免疫佐剂[2].本研究用一种新设计合成的含有CpG基序的寡核苷酸( BW006)联合HBsAg对B细胞表型和功能的影响进行研究,目的是探讨CpG作为乙肝疫苗佐剂诱导机体免疫应答的机制,为新型预防和治疗性乙肝疫苗的研发提供依据.
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通过T-A克隆技术构建含免疫刺激序列CpG基序的抗SBR DNA疫苗
目的:构建含免疫刺激序列、能够阻止变形链球菌在牙面粘附的防龋DNA疫苗.方法:根据原核表达质粒pSBR-CTA2B基因序列,设计针对编码变形链球菌表面蛋白抗原AgⅠ/Ⅱ分子中唾液蛋白结合区段(SBR)的特异性PCR引物,利用PCR技术由质粒pSBR-CTA2B扩增目的DNA片断;通过T-A克隆技术将目的DNA片段克隆于中间载体pMD18-T,鉴定插入方向后,选择插入方向正确的克隆,将目的DNA从中间载体释放,再克隆至含有CpG免疫刺激序列的真核表达载体pcDNA3.1.结果:通过对重组质粒pcDNA3.1-SBR进行酶切图谱分析和DNA序列测定分析,证明真核表达重组质粒pcDNA3.1-SBR构建成功、开放阅读框架正确.结论:利用T-A克隆等技术可成功将编码SBR的DNA片段克隆到含有免疫刺激序列CpG的真核表达载体pcDNA3.1的适当部位,构建出真核表达重组质粒pcDNA 3.1-SBR作为有效防龋的DNA疫苗.
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2型、5型腺病毒DNA与12型腺病毒DNA、大肠杆菌DNA序列的对比研究
目的 通过对2型、5型人腺病毒DNA(Adv2、5 DNA)与Adv12 DNA及大肠杆菌DNA(EC DNA)序列进行对比研究,确定Adv2、5 DNA中能够拮抗细菌DNA的可能的活性片段--抑制性CpG寡核苷酸(CpG-N ODN).方法 从NCBI核酸数据库中获取Adv2、5、12 DNA和EC DNA序列,采用DNATools、BioEdit等软件对Adv2、5、12 DNA和EC DNA进行序列分析和比较,确定Adv2、5 DNA特征性的CpG基序,查找出Adv2、5DNA中以上述CpG基序为核心的12碱基寡核苷酸(12-ODN).结果 确定了19种Adv2、5 DNA特征性的CpG基序,Adv2、5 DNA中以这19种CpG基序为核心的12-ODN共504条.结论 504条12-ODN可能是Adv2、5 DNA的CpG-N ODN.
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拮抗细菌DNA的CpG-N ODN筛选
目的 在抑制性CpG寡核苷酸(CpG-N ODN)分子设计的基础上,选择部分序列加以合成并对其生物学活性进行鉴定,筛选出能够拮抗细菌DNA的CpG-N ODN.方法 对合成的10条CpG ODN进行生物学活性的初筛和复筛,观察其自身的刺激性及其对CpG-S ODN诱导的TNF-α释放的抑制作用.使用RNAstructure version 3.71预测CpG ODN的二级结构及自由能,根据10条CpG ODN构效关系分析结果,对CpG-N ODN分子进行再设计,并从中选择11个序列进行生物活性的筛选.结果 首次合成的10条CpG ODN仅1条是对细菌DNA拮抗作用较弱的CpG-N ODN.通过对其构效关系进行分析,推测CpG ODN的生物活性可能与自由能相关.在此基础上对CpG-N ODN分子进行了再设计,合成的11条CpG ODN中有5条是拮抗作用较强的CpG-N ODN.结论 获得了6条CpG-N ODN.CpG ODN的生物活性可能与自由能密切相关.
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CpG-ODNs疫苗佐剂的研究进展
CpG寡聚脱氧核苷酸(CpG-ODNs)是一种新型免疫增强剂,大量动物实验和临床研究表明其在感染、肿瘤和过敏等疾病的预防和治疗等领域具有良好的应用前景.到目前为止,数10种含有CpG-ODNs的药物和疫苗进入人体临床研究,至少有1种药物和4种疫苗已进入或完成Ⅲ期临床研究.本文主要从CpG-ODNs免疫刺激活性的研究历程、CpG-ODNs免疫刺激活性的复杂性、CpG-ODNs疫苗佐剂的临床前以及临床研究等方面介绍CpG-ODNs作为人用疫苗佐剂的研究进展.
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活体电穿孔导入法增强恶性疟原虫核酸疫苗免疫反应研究
目的 采用活体电穿孔免疫方法,研究恶性疟原虫DNA核酸疫苗不同免疫剂量对于动物免疫反应的影响,并对载体中CpG寡脱氧核苷酸基序的免疫刺激活性进行了初步探讨.方法 将恶性疟原虫多表位嵌合抗原M.RCAg-1基因克隆于真核表达载体VR1012中,使用电穿孔导入方法免疫小鼠,采用ELISA检测抗体效价、ELISPOT测定细胞因子分泌水平,探索基因疫苗佳免疫剂量以及考察免疫反应类型.使用计算机分析恶性疟核酸疫苗中特殊CpG基序组成,实验验证基因疫苗中CpG基序的免疫刺激活性.结果 相同DNA免疫剂量下,电穿孔免疫法与单纯肌内注射免疫法相比较,小鼠血清IgG抗体效价提高118倍,且能显著诱导体内特异性Th1和Th2型细胞反应.电穿孔免疫小鼠血清可识别天然虫体抗原,抗体效价可达1∶1200.恶性疟原虫核酸疫苗抗原DNA含有24个CpG免疫活性基序,可以有效的刺激人外周血单个核细胞(PBMCs)增殖与IL-6分泌.结论 活体电穿孔方法可以显著提高恶性疟原虫DNA疫苗体液免疫和细胞免疫水平.
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重组质粒pEGFP-N1/CpG-HBcAg(ISS)转染DC培养上清诱导HepG2株凋亡的研究
目的:探讨人类乙肝核心抗原重组质粒pEGFP-N1/CpG-HBcAg(ISS)转染人外周血单核细胞来源树突状细胞后,细胞培养上清诱导肝癌细胞株HepG2凋亡的作用及机制.方法:构建真核表达质粒pEGFP-N1/CpG-HBcAg(ISSa,c),将其转染人外周血来源DC,用培养上清诱导HepG2的凋亡.用流式细胞仪检测已转染DC表面CD80和CD86的表达,检测培养上清诱导HepG2凋亡的变化.用ELISA法检测转染后DC培养上清的IFN-γ、IL-2、IL-12、IL-4和IL-10的水平.结果:pEGFP-N1/CpG-HBcAg(ISSa)转染DC表面CD80和CD86的表达均有明显升高(P＜0.01).转染后上清中Th1型细胞因子 IFN-γ、IL-2和IL-12的表达增强(P＜0.01),Th2型细胞因子IL-4和IL-10的表达下降(P＜0.05),pEGFP-N1/CpG-HBcAg(ISSa)组培养上清对HepG2细胞具有促凋亡作用,随着培养时间延长,细胞凋亡率逐渐增加,HepG2细胞在诱导后24小时凋亡率达到大,为18.4%.结论:重组质粒pEGFP-N1/CpG-HBcAg(ISSa)转染培养上清能明显促进肝癌细胞株HepG2的凋亡.
关键词： CpG基序 树突状细胞 HepG2 共刺激分子 Th1/Th2型细胞因子 -
102 CpG DNA的免疫学作用及其应用
CpG基序是以未甲基化CpG为核心的的寡聚脱氧核苷酸,对人及动物具有强烈的免疫刺激功能.CpG DNA可以直接激活抗原递呈细胞,诱导其产生IL-12、TNF-α等Th1型细胞因子;还可以间接刺激NK细胞分泌IFN-γ.鉴于它可优势诱导Th1为主的免疫应答,现已成为目前免疫佐剂研究的热点之一.本文对CpG DNA的免疫学作用及应用研究作一综述.
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CpG基序增强DNA疫苗免疫原性研究进展
DNA疫苗广泛用于细菌、病毒性疾病以及肿瘤等的预防和治疗研究,但已报道的临床实验研究表明并未取得良好的免疫效果.未甲基化胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸(CpG)寡脱氧核苷酸(oligodeoxynucleotide,ODN)具有较强的免疫佐剂特性.近年来有不少学者作了关于CpG-ODN增强DNA疫苗免疫原性的研究,本文就有关研究进展作一综述.
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CpG基序的免疫效果和作用机理
不同于脊椎动物的DNA,细菌DNA含有高得多的非甲基化CpG二核苷酸,具体说是称为"CpG基序"的碱基成分.脊椎动物的免疫系统看来可能有一种进化的将"CpG基序"视为外源物质的识别分子,能激发机体产生强烈偏向Th1型的保护性免疫应答.这些应答可以用合成的寡脱氧核糖核苷酸(ODN)来模拟,实验表明,ODN在疫苗佐剂和肿瘤及变态反应的免疫治疗方面有很大的应用潜力.
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CpG基序对HBV DNA疫苗诱导小鼠产生抗-HBs的影响
为研究CpG基序克隆人质粒载体后对乙型肝炎病毒(HBV)DNA疫苗诱导小鼠产生抗-HBs的影响.构建编码乙肝表面抗原中蛋白的卡那霉素抗性真核表达质粒pVAX-CpGS2S,其中通过PCR克隆了若干个CpG基序到质粒载体中,按不同剂量一次性肌内注射免疫小鼠,ELISA法检测小鼠血清抗-HBs.结果发现与不含CpG基序的对照组相比较,克隆了CpG基序的实验组一次性免疫BALB/c小鼠后诱导产生的抗体效价比对照组免疫效果好,但两者差异不显著.
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含CpG基序的单链寡核苷酸对感染人轮状病毒乳鼠黏膜损伤的保护作用
轮状病毒(RV)是世界各地婴幼儿感染性腹泻的主要病原之一.人们不断寻求新的预防和治疗措施来控制RV感染,然而至今尚没有理想的预防疫苗和特效治疗药物.
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CpG-ODN持续刺激对小鼠骨髓树突状细胞成熟的影响
目的:研究CpG-ODN持续刺激对小鼠骨髓树突状细胞(DC)成熟的影响.方法:小鼠骨髓细胞用GM-CSF培养7 d,持续刺激组全程加入CpG-ODN,短期刺激组在培养的后36 h加入CpG-ODN,对照组不加CpG-ODN.流式细胞仪检测细胞表型和细胞摄取抗原的能力,ELISA检测细胞产生的细胞因子,混合淋巴细胞培养检测细胞提呈抗原的能力.结果:用CpG-ODN持续刺激的小鼠骨髓DC表达MHCⅡ、CD86和CD40等分子和分泌IL-12 p70的能力并未增加,吞噬FITC-OVA的能力显著升高,刺激同种异基因T细胞和刺激同种同基因T细胞增殖的能力显著低于CpG-ODN短期刺激组.结论:CpG-ODN持续刺激可抑制DC的发育成熟,可能是持续严重感染时免疫功能低下的原因.
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体外研究CpG基序对人食管癌疫苗的佐剂效应
目的:探讨CpG基序在人食管癌Eca-109细胞疫苗研究中的佐剂效应.方法:以Eca-109细胞膜表面小肽刺激DC作为食管癌疫苗,HL-60细胞膜表面小肽刺激DC作为对照疫苗.以CpG基序作为佐剂,以CBPw作为对照佐剂,测定各组的T细胞增殖试验和CTL活性.结果:佐剂组的T细胞活性明显高于其余各组(P＜0.01);人食管癌疫苗组的T细胞活性明显高于其余各组(P＜0.01);与Eca-109细胞匹配的HLA也影响了T细胞活性的发挥.结论:CpG基序是人食管癌疫苗的有效佐剂,HLA对T细胞功能有影响.
关键词： CpG基序 树突状细胞 组织相容性白细胞抗原 食管癌 -
CpG基序和TLR9与系统性红斑狼疮的研究进展
系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE) 是一种复杂的非器官特异性自身免疫性疾病,其主要特征之一是患者体内存在针对特异性ds-DNA和其他细胞核抗原成分的自身抗体,形成的抗原抗体复合物可沉积于组织和器官,引起临床上多系统受累的表现.Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)是天然免疫中重要的模式识别受体(pattern recognition receptor,PPR),TLRs识别内、外源性配体后,启动炎性应答信号通路、诱导炎性因子表达而对机体组织产生保护或损伤作用.其中Toll样受体9(TLR9)及其特异性配体未甲基化的胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤(CpG)之间的相互作用与SLE的关系尤为密切.现将CpG基序和TLR9与SLE的研究进展作一综述.
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DNA疫苗的研究进展
DNA疫苗是20世纪90年代发展起来的一项崭新的免疫技术,由Tang[1]等首次报道,随后引起了广泛的关注.大量的疫苗研制工作如抗流感疫苗、HIV疫苗、乙肝病毒疫苗和肿瘤相关抗原疫苗等相继报道,被称为"第三次疫苗革命"[2],是继减毒疫苗、基因工程疫苗之后的第三代疫苗.DNA疫苗具有免疫刺激活性的结构基础是非甲基化的CpG基序(CpG motif),又称为免疫刺激序列(ISS,immunostimulatory sequences).另外有人将含有CpG基序的DNA称为CpG DNA,将含有CpG基序的寡核苷酸(ODN,oligonucleoetide)称为CpG ODN.DNA疫苗在治疗、预防感染性疾病、变态反应疾病和肿瘤治疗等方面,具有强大的发展潜力.
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CpG ODN免疫活性及其抗肿瘤作用的研究进展
含有CpG基序的脱氧寡核苷酸(CpG oligodeoxynucleotide,CpG ODN)广泛存在于细菌DNA中,能激活多种免疫细胞,产生多种细胞因子,具有强烈的免疫激活功能,已成为肿瘤免疫治疗研究领域的新热点[1].
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CpG基序在人食管癌Eca-109细胞疫苗中的佐剂效应
目的:探讨CpG基序在人食管癌Eca-109细胞疫苗中的佐剂效应.方法:培养Eca-109细胞,用酸洗法收集细胞膜表面小肽,再用去盐、浓缩、超滤法纯化这些小肽后,以此刺激人外周血树突状细胞(DC)作为人食管癌疫苗,不用小肽刺激的DC作为对照疫苗,并用这些疫苗加佐剂CpG基序激活纯化的T细胞.实验分组:①CpG基序加食管癌疫苗组(CpG-Ve);②CpG基序加食管癌对照疫苗组(CpG-Vc);③单纯食管癌疫苗组(Ve);④单纯食管癌对照疫苗组(Vc);⑤单纯CpG基序刺激组;⑥直接用纯化的T细胞加Eca-109细胞作效应对照组.用3H渗入法对各组行T细胞增殖试验,用51Cr释放试验测定各组细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的活性.结果:CpG-Ve组的T细胞增殖活性和CTL对Eca-109细胞杀伤率均高于其余各组(P＜0.01).结论:CpG基序可能是人食管癌疫苗研究中的有效佐剂.
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硫代修饰的CpG基序及IL一2表达质粒对癌胚抗原DNA疫苗诱导抗体的影响
目的探讨增强癌胚抗原DNA疫苗在BALB/c小鼠体内诱导的体液免疫应答的方法.方法将合成的、经硫代修饰的CpG基序和IL-2表达质粒分别作为免疫刺激剂与癌胚抗原(CEA)DNA疫苗一起肌肉注射小鼠,ELISA法检测动物体内产生CEA和抗-CEA的水平.结果单独以CpG基序或IL-2表达质粒做免疫刺激剂均不能增加CEA的表达,但都能促进抗-CEA的产生(P＜0.05).结论CpG基序和IL-2表达质粒对DNA疫苗产生抗体有促进作用.
