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两种CpG基序能高度活化人免疫细胞
目的筛选活化人免疫细胞的CpG基序(CpG motif),设计对人免疫细胞有强免疫刺激活性的CpG寡脱氧核苷酸(CpG-ODN). 方法设计合成含有5′-CG-3′二核苷酸、长度为12个碱基的硫代修饰CpG-ODN,并利用体外培养的人外周血单个核细胞(PBMC),以培养上清中的IgM水平为指标,筛选能够活化人免疫细胞的CpG基序.根据筛选获得的活性CpG基序,设计一组含有2～6拷贝CpG基序、长度为15～30个碱基的CpG-ODN,从中筛选对人免疫细胞有强免疫刺激活性的序列. 结果发现了多个活性CpG基序,其中5′-GACGTT-3′,5′-GACGTC-3′,5′-GGCGTT-3′和5′-GGCGTC-3′等4个基序对人B细胞有中度免疫刺激活性,和已发表的小鼠CpG基序完全一致;5′-GTCGTT-3′和5′-GTCGTC-3′ 2个基序对人B细胞有高度免疫刺激活性,第二位碱基均为“T”,而在小鼠CpG基序中该位碱基为“G”或“A”.根据后2个CpG基序,设计了多个对人免疫细胞有高度免疫刺激活性的CpG-ODN. 结论人免疫细胞中存在有高度免疫刺激活性的CpG基序和CpG-ODN.
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CpG ODN联合光动力疗法对肝癌移植瘤生长及局部CD8+细胞毒性T细胞的影响
目的 探讨以CpG寡脱氧核苷酸(ODN)为免疫佐剂联合光动力疗法(PDT)的光免疫疗法(PIT)对小鼠Heps肝癌移植瘤的抗肿瘤及免疫效应.方法 92只ICR小鼠皮下接种肝癌Heps细胞建立荷瘤鼠模型,随机分为对照组、PDT组、CpG ODN组和PIT组,治疗后定期测量各组肿瘤体积,计算抑瘤率.免疫组化法计数肿瘤局部CD8+细胞毒性T细胞(CD8+CTLs).结果 (1)与埘照组相比,PDT组、CpG ODN组和PlT组治疗后16d肿瘤体积均明显缩小(P<0.01),抑瘤率分别为73.88%、20.09%、84.47%.PIT组肿痛体积较单纯PDT组明显缩小(P<0.05).(2)免疫组化染色结果显示,PDT组、CpG ODN组和PIT组治疗后2、24h肿瘤局部CD8+CTLs数量较对照组无明显变化(P>0.05),治疗后72h肿瘤局部CD8+CTLs数量,均明显高于对照组(P<0.05);PIT组肿瘤局部CD8+CTLs数量明显高于单纯PDT组(P<0.01).结论 CpG ODN能激活宿主免疫应答而有效增强PDT对小鼠Heps肝癌移植瘤的抗肿瘤及免疫效应.
关键词： 光动力疗法 CpG寡脱氧核苷酸 CD8+细胞毒性T细胞 Heps肝癌 小鼠 -
CpG寡脱氧核苷酸刺激培养对慢性淋巴细胞白血病细胞染色体分析的影响
6%,组合探针荧光原位杂交异常核型检出率为64.3%.结论 应用CpG寡脱氧核苷酸刺激培养CLL细胞,可提高染色体异常检出率.
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CpG-ODN活化人NK细胞的初步研究
目的:研究D型CpG-ODN对人免疫细胞的活化效应.方法:CpG-ODN体外刺激人外周血单个核细胞(PBMC),ELISA检测培养液IFN-α及IFN-γ的含量;RT-PCR检测PBMC中TLR9的表达水平;MTT法观察活化的NK对K562的杀伤作用.结果:CpG-ODN有效诱导PBMC分泌IFN-α和IFN-γ,增强活化的NK细胞对K562细胞的杀伤作用,且能显著上调TLR9 mRNA的表达.结论:在TLR9的介导下,CpG-ODN能有效激活NK细胞,参与机体免疫调节.
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CpG ODN对rHBsAg免疫小鼠Th1/Th2型免疫应答的影响
目的:初步探讨CpG寡脱氧核苷酸(CpG ODN)与重组乙型肝炎表面抗原(rHBsAg)联合免疫小鼠的Th1/Th2型免疫应答效应.方法:BALB/c小鼠经后腿胫骨前肌免疫2次,ELISA法检测血清乙型肝炎表面抗体(抗-HBs)IgG亚类IgG2a/IgG1的比值;生物活性法检测脾细胞诱生上清中的IFN-γ和IL-2含量;ABC-ELISA法检测小鼠血清中IL-4、IL-10及IL-12含量.结果:加CpG ODN组与单独注射rHBsAg组相比:抗-HBs IgG亚类IgG2a/IgG1比值明显高;Th1型细胞因子IFN-γ、IL-2和IL-12的表达增强,抑制Th2型细胞因子IL-4和IL-10的产生.结论:CpG ODN能够明显增强rHBsAg免疫小鼠Th1型抗体亚类IgG2a的产生,并且诱导Th1型细胞因子的表达,抑制Th2型细胞因子的表达.
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CpG ODN对破骨细胞分化调控作用的研究进展
CpG ODN(CpG oligodeoxynucleotides)是一类可模拟细菌DNA免疫活性效应的寡脱氧核苷酸,其生物学功能受自身结构特征影响.特定序列的CpG ODN可通过与破骨细胞前体、前破骨细胞、成骨细胞表面的TLR9结合,调节RANKL、M-CSF、TNF-a、IL-12、TREM-2等细胞因子的表达水平,促进或抑制破骨细胞的形成与分化.本文就CpG ODN对破骨细胞(osteoclast,OC)分化调控作用的研究进展加以综述.
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含CpG的寡脱氧核苷酸与5-氟尿嘧啶联用治疗小鼠肝癌
目的探讨含CpG的寡脱氧核苷酸(ODN)单独及与5-氟尿嘧啶(5-FU)联用对小鼠移植性肝癌的治疗作用.方法Balb/c小鼠皮下接种肝癌H22细胞建立荷瘤鼠模型,肿瘤周围皮下分别注射生理盐水(对照组)、无CpG ODN、5-FU、CpG ODN和CpG ODN+5-FU后,定期测量肿瘤大小.用酶联免疫吸附实验检测鼠血清白细胞介素(IL)-12和干扰素(IFN)-γ含量;用乳酸脱氢酶释放法检测鼠脾脏自然杀伤(NK)细胞活性.结果与对照组肿瘤体积[(6710±910)mm3]比较,CpG ODN、CpGODN+5-FU及单用5-FU治疗后,肿瘤体积分别为(3579±481)mm3、(1998±474)mm3及(2124±434)mm3(P值均＜0.01).对照组鼠血清IL-12和IFN-γ的含量分别为(238±45)pg/ml和(57±8)pg/ml,与CpG ODN组[IL-12:(464±24)pg/ml;IFN-γ:(134±26)pg/ml]及CpG ODN+5-FU组[IL-12:(336±29)pg/ml;IFN-γ:(111±5)pg/ml]比较,差异有统计学意义(P值均＜0.05).CpG ODN+5-FU组小鼠血清IL-12及IFN-γ水平显著高于5-FU组[IL-12:(167±53)pg/ml;IFN-γ:(53±17)pg/ml;P＜0.05].与对照组NK细胞的杀伤活性[(19.2±1.0)%]相比,CpG ODN组[(44.0±1.4)%]及CpG ODN+5-FU组[(30.7±1.3)%]显著增强(P值均＜0.05),且CpG ODN+5-FU组显著高于5-FU治疗组[(12.0±1.4)%,P＜0.05].无CpG ODN对鼠肿瘤生长、血清IL-12和IFN-γ含量及NK细胞活性无影响.结论CpG ODN能激活荷瘤鼠抗肿瘤免疫反应以抑制小鼠移植性肝肿瘤生长并能增强5-FU化疗鼠的免疫功能.
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含CpG免疫刺激序列的质粒增强HBsAg诱导的免疫应答
目的 探讨以含有多拷贝CpG寡脱氧核苷酸(CpG ODN)的质粒作为治疗性乙肝疫苗佐剂的可行性.方法 构建含有6个拷贝D型CpG ODN的质粒pKO-CG6,将该质粒以及载体pKO分别刺激健康人及HBV感染者的外周血单核细胞(PBMC),检测PBMC的增殖及分泌的细胞因子IFN-γ、IL-12,进一步将重组HBsAg分别联合这两种质粒免疫小鼠,检测小鼠的细胞和体液免疫应答.结果 质粒pKO-CG6与载体pKO在体外均能有效激活健康人及HBV感染者PBMC增殖反应,并促进IFN-γ、IL-12的产生,其中pKO-CG6的免疫刺激活性强于载体pKO.小鼠体内试验表明,虽然载体pKO也具有免疫佐剂作用,但pKO-CG6更能显著增强HBsAg诱导的免疫应答,尤其是细胞免疫应答.结论 含有多拷贝D型CpG ODN的质粒能有效激活HBV感染者的PBMC,并增强HBsAg在小鼠体内的免疫原性.
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CpG ODN 对活动性肺结核患者外周血Th1/Th2型免疫应答的调节作用
目的观察CpG寡脱氧核苷酸(CpG ODN)对活动性肺结核患者外周血单个核细胞(PBMC)γ干扰素(IFN-γ)、白细胞介素(IL)-12以及IL-10表达的影响.方法20例活动性肺结核患者和20名健康人PBMC根据刺激物不同分为空白对照组、结核菌素纯化蛋白衍化物(PPD)组(10 ng/mL)、CpG ODN组(2 nmoL/mL)和CpG ODN+PPD组.用real time-PCR法检测PBMC IFN-γmRNA、IL-12 mRNA和IL-10 mRNA的表达.结果①活动性肺结核患者PBMC空白对照组IFN-γ mRNA和IL-12 mRNA的表达低于健康人(P＜0.01,P＜0.05),IL-10 mRNA的表达与健康人相似(P＞0.05);②经PPD刺激,IFN-γ mRNA、IL-12 mRNA和IL-10mRNA的表达较空白对照组增高(P＜0.01,P＜0.01,P＜0.01),但IFN-γ mRNA的表达低于健康人(P＜0.01),IL-12 mRNA的表达与健康人相似(P＞0.05),IL-10 mRNA的表达高于健康人(P＜0.01);③经CpGODN刺激,IFN-γmRNA和IL-12 mRNA的表达高于空白对照组(P＜0.01,P＜0.01),但低于健康人(P＜0.01,P＜0.05),IL-10 mRNA的表达与空白对照组相似(P＞0.05),与健康人也无差别(P＞0.05);④经CpGODN+PPD刺激,IFN-γ mRNA和IL-12 mRNA的表达较空白对照组增高(P＜0.01,P＜0.01),但IFN-γ mR-NA的表达低于健康人(P＜0.01),IL-12 mRNA的表达与健康人相似(P＞0.05),IL-10 mRNA的表达与空白对照组相似(P＞0.05),与健康人也无差别(P＞0.05);⑤经CpGODN+PPD刺激,肺结核患者IL-12 mRNA的表达高于PPD组(P＜0.05),IL-10mRNA的表达低于PPD组(P＜0.01).结论CpGODN可促进活动性肺结核患者PBMC产生IFN-γ和IL-12,增强Th1型免疫反应.CpGODN与PPD联合应用可进一步促进PPD对IL-12表达的诱导,并抑制PPD对IL-10表达的增强作用.
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K型和D型CpG寡脱氧核苷酸对猪外周血单个核细胞免疫刺激活性的比较研究
目的:比较K、D两型CpG寡脱氧核苷酸(CpG 0DN)对猪外周血单个核细胞(PBMC)免疫刺激活性的差异.方法:用人工合成的@K型和D型两类CpG 0DN和不含CpG基元的对照0DN D48分别刺激已分离的猪PBMC,3H-TdR掺入法测定每分闪烁次数(cpm)值,计算刺激指数(SI).双抗体夹心ELISA法测定活化细胞上清中IFN-γ和IL-2表达水平.结果:D和K型CpGODN对猪PBMC增殖均具有较强刺激作用,K型的增殖效应高于D型.含"GTCGTT"基元的2006作用尤为显著,但不能有效刺激猪PBMC分泌IFN-γ和IL-2.D型刺激增殖效应低于K型,但能有效地促进猪PBMC分泌IFN-γ和IL-2.结论:K型和D型CpG 0DN在刺激猪PBMC增殖及其分泌IFN-γ、IL-2的水平有所不同.
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CpG联合恩替卡韦在体内诱导早期病毒学应答抑制土拨鼠肝炎病毒的复制
目的:研究CpG寡脱氧核苷酸对嗜肝病毒复制和基因表达的抑制作用及其作用机制,探索抗病毒治疗的新方法.方法:利用土拨鼠肝炎模型研究P类CpG的免疫刺激和抗病毒活性.土拨鼠肝炎病毒(woodchuck hepatitis virus,WHV)慢性感染的土拨鼠12只分为4组,分别接受CpG皮下注射(4 mg/kg,每周1次,共16周)、恩替卡韦(entecavir,ETV)饲养(0.5 mg·kg-1·d-1,共12周)、CpG联合ETV治疗,或不处理作为对照.在处理后的第1、2、3天,1、2、3、4、8、12、16、20、24和28周,采用定量PCR检测血清WHV载量和PBMC内ISGs mRNA的水平,ELISA检测WHsAg (WHV surface antigen)水平,生物活性分析血清IFN水平.结果:相比对照组和CpG或ETV单独治疗组,CpG联合ETV治疗显著抑制WHV的复制和表达,出现早期病毒学应答并强烈抑制血清WHsAg抗原水平.CpG联合ETV治疗组的4只动物中有3只在治疗的13～17周后血清WHsAg低于检测下限.另外,接受CpG治疗的大部分动物血清中检测到IFN、PBMC中MxA mRNA显著上调(10～100倍).结论:P类CpG在慢性WHV感染的土拨鼠体内诱导天然免疫,从而产生强烈的病毒抑制作用.通过优化方法达到长期持续的病毒抑制效果,将促进在HBV感染的个体开展类似的研究,从而开发成为乙型肝炎治疗的新方法.
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TLR9在 CpG寡脱氧核苷酸所致种属特异性免疫效应中的意义
目的:探讨TLR9在CpG寡脱氧核苷酸(CpG-ODN)种属特异性免疫效应中的意义.方法:CpG-ODN体外刺激人、猕猴、小鼠外周血单个核细胞(PBMC),ELISA测培养液IFN-α含量;RT-PCR检测PBMC中TLR9的表达水平.结果:CpG-ODN 2216有效诱导人PBMC分泌IFN-α,而对猕猴和小鼠却无明显的免疫刺激活性;TLR9在人PBMC中均有表达,并且在CpG-ODN介导激活的人PBMC中表达上调;TLR9在猕猴PBMC中不表达.结论:TLR9是构成CpG-ODN种属特异性的重要分子基础.
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CpG-ODN活化的外周血单个核细胞体外对肿瘤细胞杀伤效应的研究
目的 探讨CpG ODN体外活化的外周血单个核细胞(PBMC)后对肿瘤细胞的杀伤效应.方法 CpG-ODN体外刺激人外周血单个核细胞(PBMC),将活化的PBMC与肿瘤细胞按50∶1的比例共孵育72h后,以MTT和酶学检测活化的PBMC对肿瘤细胞的杀伤作用.结果 CpG-ODN诱导活化的PBMC对肿瘤细胞的杀伤作用增强,而对正常肝细胞则无明显的杀伤作用.结论 CpG-ODN可诱发机体免疫效应,提高对肿瘤细胞的杀伤作用.
关键词： CpG寡脱氧核苷酸 外周血单个核细胞(PBMC) 免疫调节 -
氩氦刀冷冻联合CpG寡脱氧核苷酸治疗小鼠皮下移植性结肠癌
目的 探讨氩氦刀冷冻消融联合CpG寡脱氧核苷酸(ODN)对小鼠移植性结肠癌的治疗作用.方法 BALB/c小鼠皮下接种结肠癌CT26细胞建立荷瘤鼠模型,小鼠被分成PBS组(6只,瘤周注射PBS组)、氩氦刀组(6只,氩氦刀冷冻组)、CpG ODN组(6只,瘤周注射CpG ODN)和联合治疗组(6只,氩氦刀冷冻加瘤周注射CpG ODN).观察各组小鼠存活及肿瘤生长情况;采用酶联免疫吸附试验检测小鼠外周血中IL-12和IFN-γ的含量;利用流式细胞仪检测小鼠外周血中CD3+CD4+T细胞与CD3+CD8+T细胞比例;对氩氦刀组和氩氦刀联合CpG ODN组治愈小鼠进行再攻击实验,观察小鼠再次成瘤率.结果 氩氦刀组和联合治疗组小鼠的平均生存时间为(80.3±5.4)d和(83.8±5.5)d,明显长于PBS组[(53.7±3.7)d]和CpG ODN组[(51.5±6.8)d],差异均有统计学意义(P＜0.05).氩氦刀组和联合治疗组抑瘤率分别为83.8%和86.2%.治疗后20 d,氩氦刀组和联合治疗组的CD3+CD4+T细胞/CD3+CD8+T细胞比值、IL-12和IFN-γ水平均高于PBS组和CpGODN组,差异有统计学意义(P＜0.05);与氩氦刀组比较,联合治疗组CD3+CD4+T细胞/CD3+CD8+T细胞比值差异无统计学意义,但IL-12和IFN-γ水平则显著升高(P＜0.05).肿瘤再攻击后,氩氦刀组和联合治疗组分别有5只(5/6)和1只(1/6)再次成瘤,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 氩氦刀冷冻联合CpG ODN可以增强荷瘤鼠的抗肿瘤免疫应答,增强了氩氦刀治疗小鼠的免疫功能,减少了肿瘤再次攻击的成瘤率.
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CpG寡脱氧核苷酸序列的设计与筛选
目的:根据CpG 寡脱氧核苷酸(CpG ODN)的设计原则,设计和筛选对新生儿脐血单个核细胞免疫刺激作用较强的CpG ODN;从中探求CpG ODN的结构与免疫刺激活性之间的关系.方法:根据目前有关CpG ODN免疫刺激活性的研究资料,设计合成15条不同结构特点的硫代及非硫代修饰的CpG ODN,MTT法检测CpG ODN对脐血中单个核细胞的刺激作用,分别筛选出作用较强的CpG ODN, 然后以CpG2006和T8为阳性对照,无关序列CpG17为阴性对照,再次比较这些CpG ODN对单个核细胞的刺激增殖作用.结果:设计的2条CpG ODN 吸光度A值(CpG1:0.280±0.061 2;CpG6:0.277±0.056 2)高于T8(0.241±0.043 8),而与CpG2006(0.283±0.079 4)相当.结论:用MTT法筛选出了2条对新生儿免疫作用较强的CpG ODN;CpG ODN的结构与其免疫活性密切相关,这些关系特点利于指导CpG ODN的设计.
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CpG寡脱氧核苷酸对1型糖尿病患者外周血单个核细胞功能的影响
目的:观察CpG寡脱氧核苷酸(ODN)对1型糖尿病患者与健康志愿者外周血单个核细胞(PBMC)γ干扰素(IFN-γ)、白细胞介素(IL)-12以及IL-10表达的影响.方法:将1型糖尿病患者与健康志愿者的PBMC根据刺激物不同分为对照组、CpG组(CpGODN 2nmol·mL~(-1)).用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测PBMC IFN-γmRNA、IL-12mRNA和IL-10mRNA的表达.结果:1型糖尿病患者IFN-γmRNA和IL-12mRNA的表达明显低于健康志愿者;1型糖尿病患者与健康志愿者PBMC经CpG ODN刺激后,IFN-γmRNA和IL-12mRNA的表达均高于对照组(P<0.01,P<0.01),IL-10mRNA的表达与对照组相似(P>0.05).结论:1型糖尿病患者PBMC表达IFN-γ和IL-12下降,CpG ODN可促进其表达,增强其免疫调节能力.
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CpG-ODN对慢性乙型肝炎患者PBMC免疫刺激作用的观察
目的 观察CpG-ODN体外对慢性乙型肝炎患者PBMC的免疫刺激效应.方法 CpG-ODN体外刺激慢性乙肝患者外周血单个核细胞(PBMC),用ELISA检测培养液中IFN-α的水平;将不同比例的PBMC培养上清与HepG2.2.15细胞共孵育4和8 d后,用ELISA和荧光定量PCR法,分别检测培养上清液中HBsAg、HBeAg和HBV DNA的水平;MTT法观察活化的PBMC培养上清液对HepG2.2.15的杀伤作用.结果 CpG-ODN可有效诱导慢性乙肝患者PBMC分泌IFN-α,增强其活化的PBMC培养上清液对HepG2.2.15的杀伤作用;CpG-ODN本身虽不能直接抑制HBV的复制,但可通过其活化的PBMC的培养上清抑制HepG2.2.15细胞产生HBsAg、HBeAg和HBV DNA.结论 CpG-ODN可有效激活慢性乙肝患者的免疫细胞,发挥抗病毒效应.
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CpG-ODN对慢性乙型肝炎患者外周血单个核细胞T-bet表达的影响
目的探讨T-bet在乙型肝炎病毒(HBV)感染中的作用以及CpG-ODN对其表达的调节作用.方法应用半定量RT-PCR,对22例慢性乙型肝炎活动期患者、10例HBsAg阳性无症状携带者和12例正常对照外周血单个核细胞(PBMC)T-bet的表达进行检测;同时用CpG-ODN体外刺激以上3组实验对象的PBMC,RT-PCR观察T-bet的表达情况.结果无症状携带者T-bet表达低,慢性乙型肝炎活动期患者T-bet表达高;经CpG-ODN刺激后,无症状携带者和正常对照的T-bet表达明显上调.结论 T-bet在HBV感染的不同状态中具有差异表达,提示T-bet可能参与了机体抗HBV的免疫应答,具体的机制有待进一步研究.CpG-ODN作为一种新型的免疫调节剂,可在一定程度上恢复HBV感染者特别是无症状携带者的Th1型细胞免疫应答.
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CpG-ODN联合抗CD40抗体活化小鼠调节性B细胞抑制CD4+T细胞增殖
目的 分析CpG寡脱氧核苷酸(CpG-ODN)联合抗CD40抗体刺激后的调节性B细胞(Breg)对其免疫调节功能的影响.方法 用流式细胞分选仪分选小鼠脾脏CD5+ CD1dhigh Breg与CD5-CD1dlowB细胞亚群,CpG-ODN联合抗CD40抗体激活24h,再与纯化的CD4+T细胞共培养,流式细胞术检测活化后的Breg及对照CD5-CD1dlowB细胞亚群白细胞介素10(IL-10)的表达,以及共培养抗CD3抗体联合抗CD28抗体激活的CD4+T细胞的增殖与γ干扰素(IFN-γ)的水平.结果 CpG-ODN联合抗CD40抗体激活的CD5+CD1dhighBreg亚群与CD4+T细胞共培养时能明显抑制活化的CD4+T细胞的增殖,同时IFN-γ的水平降低;而CpG-ODN联合抗CD40抗体刺激后的对照B细胞亚群则不能抑制CD4+T细胞的增殖与IFN-γ分泌.CD5+ CD1dhighBreg亚群在CpG-ODN联合抗CD40抗体刺激24h,IL-10的表达水平明显高于CD5-CD1dlowB细胞亚群.结论 体外CpG-ODN联合抗CD40抗体刺激后的CD5+ CD1dhighBreg亚群通过分泌IL-10抑制CD4+T细胞的活化.
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CpG寡脱氧核苷酸增强免疫抑制小鼠对乙肝疫苗的免疫应答
目的: 探讨CpG 寡脱氧核苷酸(ODN)增强免疫抑制小鼠对乙肝疫苗的免疫应答效果.方法: 选用环磷酰胺(CTX)所致免疫抑制模型小鼠, 以乙肝疫苗和20 μg CpG ODN联合或单独左胫前肌肌注免疫C57BL/6小鼠.2 wk后以同样剂量加强免疫1次, 再过3 wk后摘除眼球取血, 用ELISA法检测抗-HBs IgG抗体和IL-12的水平.同时, 无菌取脾脏做HE染色, 观察脾脏淋巴细胞的数量和细胞核的变化.结果: CpG ODN与疫苗联合注射组产生的绝对抗体量比单独注射疫苗组提高1倍; 注射组产生IL-12的水平较单独注射疫苗组也有明显升高.光镜下各组脾脏淋巴细胞的变化如下: 正常对照组脾脏可见大量的淋巴细胞; 与正常对照组相比较, CTX组的淋巴细胞明显稀少; 而CTX加CpG组的淋巴细胞数明显增多, 细胞核也明显增大.结论: CpG ODN能增强免疫抑制小鼠对乙肝疫苗的免疫应答.
