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鼠疫耶尔森菌caf1基因的克隆表达及其产物免疫学评价
目的 表达具有免疫学活性重组F1抗原(rF1),并以其构建检测鼠疫抗体胶体金试纸条.方法 将去掉信号肽编码序列的caf1基因片段与载体质粒pET32a(+)通过BamHI和Not I双酶切位点进行连接,将重组质粒[caf1-pET32a(+)]转化入BL21(DE3)中进行诱导表达,表达产物经亲和层析纯化,以纯化rF1及天然F1抗原制备双检测鼠疫抗体胶体金标试纸条,并对浙江省528份人血清标本进行检测.结果含caf1-pET32a(+)的BL21(DE3),经诱导产生相对分子质量(M_r)约为35.5×10~3的rF1融合蛋白;rF1融合蛋白检测鼠疫抗体的敏感性等同甚至超越天然F1抗原;在528份人血清标本的检测中,rF1与天然F1的符合率为97.9%(K=0.466),有较好一致性.结论 制备的rF1,具有良好免疫学活性,该rF1可替代天然F1抗原,用于鼠疫免疫学检测.
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重组鼠疫菌F1抗原制备胶体金免疫层析试纸条的研制与现场应用评价
目的 表达和纯化重组鼠疫菌F1抗原(rF1),构建胶体金免疫层析试纸条(GICA),检测和评价该试纸条的现场应用效果.方法 以镍离子金属螯合(Ni-NTA)亲和层析柱和脱盐柱对rF1进行纯化并构建GICA,应用GICA、双抗原夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)和间接血球凝集试验(IHA)3种方法对1份鼠疫菌免疫兔血清和1 685份现场血清样本(包括94份人、939份犬、34份猫、609份鼠和9份旱獭)进行F1抗体检测.结果 rF1得到高效表达并实现较好纯化.GICA、ELISA、IHA 3种方法检测1份鼠疫菌免疫兔血清,结果均为阳性,低检测滴度ELISA法高于GICA法(1∶10×211比1∶10×29),GICA法高于IHA法(1∶10×29比1∶10×28).对1 685份现场血清样本进行检测,GICA法阳性89份(5.28％),IHA法阳性53份(3.15％),ELISA法阳性101份(5.99％);GICA法与IHA法的总符合率为97.3％,与ELISA法的总符合率为97.9％.配对资料x2检验结果显示,GICA法阳性检出率高于IHA法(x2=26.63,P＜0.05),但与ELISA法比较,差异无统计学意义(x2=3.36,P＞0.05).结论 rF1表达和纯化成功,用其构建的GICA特异性强,敏感性高,与IHA、ELISA法结合应用,能有效提高鼠疫检测的速度和质量.
关键词： 鼠疫 重组F1抗原 胶体金免疫层析试纸条 应用评价 -
重组鼠疫菌F1抗原的纯化及其在ELISA检测鼠疫免疫中的应用
从表达rF1抗原的大肠杆菌中以Superdex-200凝胶过滤层析纯化rF1抗原,电泳扫描显示纯化率＞90%.SDS-PAGE及琼脂免疫双扩散结果显示纯化的rF1抗原具天然F1抗原的活性.将此纯化的rF1抗原用于间接ELISA分析免疫动物血清中抗F1抗体的水平,并与天然F1抗原相比较,证明rF1抗原优于天然F1抗原分析结果,可用于鼠疫的血清学检测.
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重组鼠疫菌F1抗原在大肠杆菌中的表达及免疫原性分析
利用基因重组技术,用pET42(b+)质粒在大肠杆菌DE3中表达鼠疫菌F1抗原.经分析rF1抗原基因序列与天然F1抗原结构基因序列完全一致,电泳扫描测其表达量为25%:Western Blot结果表明,rF1抗原可与F1特异性抗体相互作用,具有天然F1抗原的活性.用镍离子亲和层析纯化rF1抗原免疫BALB/c小鼠,在其血清中可检测到高滴度的抗F1抗体.
