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猴头菌麦角甾醇高产菌株选育及深层培养条件的优化
通过单因素实验确定猴头菌液态发酵培养的优碳源、氮源、无机盐；在此基础上，采用三因素三水平正交实验方法，确定液态深层发酵的培养条件；采用自然选育和紫外诱变法，筛选出麦角甾醇产量较高的猴头菌株。结论表明：葡萄糖2%、酵母膏0.5%、磷酸二氢钾0.15%、硫酸镁0.075%、蛋白胨1%、起始pH值5.0、装液量80 mL、接种量6 mL，温度23℃、摇床转速150 r/min条件下，猴头菌生长情况良好；紫外线照射40 s的菌株在平板培养基上生长好，摇瓶发酵后发酵液、菌丝球、菌丝粉中麦角甾醇含量分别为：0.06225 mg/10 mL、9.6862 mg/g、18.4403 mg/g，明显高于对照组。
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高效液相色谱法测定上海市不同室内环境屋尘中麦角甾醇的含量
目的建立了室内屋尘麦角甾醇含量的高效液相色谱测定方法,考察该方法用于室内屋尘麦角甾醇检测的可行性,并对上海市不同功能分区室内屋尘麦角甾醇含量进行检测,以期将其作为真菌生物量的标志物.方法在2004年12月～2005年1月间,选取了上海市区典型的9个不同功能分区的室内环境,分别代表不同的室温条件、通风情况、有无空调取暖设备、人员活动及宠物饲养情况等.用吸尘器采集屋尘,配合过筛的方法,加甲醇超声提取,过滤、冷凝回流、皂化、蒸干后高效色谱仪定量分析,并结合气质联用技术进行定性以及分子结构的分析.结果标准曲线的范围为0.02～0.80g/L,线性良好,低检测浓度为0.0005g/L;日内及日间相对标准差分别为10.2%～11.7%和4.54%～7.34%,绝对回收率为77.1%～80.1%.现场结果表明,麦角甾醇含量随采样点的不同有较大差异,大体上与温度、人流活动情况成正相关,与自然通风状况成负相关,高可迭66.0μg/g屋尘.结论本方法灵敏、准确、稳定,可用于环境中麦角甾醇的含量测定,并结合气质联用技术,复核结果的可靠性.实际采样结果表明上海市各功能分区的室内环境中普遍存在不同程度的真菌污染.
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人工虫草与冬虫夏草成分的比较研究
目的 比较人工北虫草、发酵虫草菌粉和冬虫夏草中,核苷及碱基类成分、甘露醇及麦角甾醇的含量,为开发利用虫草的药用价值提供理论依据.方法 采用RP-HPLC法测定虫草中核苷及碱基类成分,采用HPLC-ELSD法分析虫草中甘露醇的含量,采用RP-HPLC法分析虫草中麦角甾醇的含量.结果 11批冬虫夏草中核苷及碱基类成分(尿嘧啶、尿苷、肌苷、鸟苷、腺嘌呤、腺苷和虫草素)的平均含量分别为0.008 0、0.738 8、0.251 1、0.200 6、0.003 7、0.229 4、0.005 0 mg/g.10批人工北虫草中核苷及碱基类成分的平均含量分别为0.012 3、0.110 0、0.081 2、0.6480、0.001 6、0.071 5、0.699 9 mg/g,12批发酵虫草菌粉中核苷及碱基类成分的平均含量分别为0.017 0、1.057 1、0.127 9、0.9448、0.009 7、1.232 8、0.029 0 mg/g;冬虫夏草、人工北虫草、发酵虫草菌粉中甘露醇的平均含量分别为88.66、44.23、17.40 mg/g;冬虫夏草、人工北虫草、发酵虫草菌粉中麦角甾醇的平均含量分别为1.723 8、5.1233、5.321 9 mg/g.结论 人工北虫草、发酵虫草菌粉含有与冬虫夏草相似的主要活性成分,但人工虫草与冬虫夏草中各种活性成分的含量存在差异.
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不同产地蝉花中腺苷、虫草素和麦角甾醇的含量比较
目的 分析比较10批不同产地蝉花中腺苷、虫草素和麦角甾醇的含量,为蝉花的质量评价及生产用药的筛选提供方法和基础数据.方法 采用高效液相色谱法分别测定不同产地蝉花中腺苷、虫草素和麦角甾醇的含量.结果 腺苷以江苏茅山的蝉花含量高,为44.957μg/g,广西玉林的低,为11.331μg/g;虫草素以四川宜宾的含量高,为191.725μg/g,江西九江的蝉花含量低,为25.437μg/g;各产地麦角甾醇含量差异相对较小,范围为120.024~301.652μg/g.结论 不同产地蝉花中的腺苷、虫草素和麦角甾醇的含量差异较大;该方法适用于蝉花中腺苷、虫草素和麦角甾醇的含量测定,为其质量评价提供参考.
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HPLC同时测定冬虫夏草中腺苷、虫草素和麦角甾醇
目的:建立同时测定冬虫夏草药材中腺苷、虫草素和麦角甾醇的方法.方法:Diamosil C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5μm),流动相甲醇-水梯度洗脱,体积流量1.0 mL· min-1,柱温30℃,进样量10μL,检测波长260 nm.结果:腺苷、虫草素和麦角甾醇分别在0.032 2 ～0.805,0.015 4 ～0.385,0.084 3 ～2.107 5μg线性关系良好,回归方程分别为Y=2 573X+0.737 8;Y=2 631X +0.624 4；Y=2315X+0.4829,平均加样回收率分别为98.94％(RSD 1.16％),99.73％ (RSD 2.19％),99.55％(RSD 2.02％).结论:该方法准确性高,重复性好,可作为冬虫夏草药材的质量控制方法.
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高山绚孔菌化学成分研究
目的:研究高山绚孔菌子实体化学成分.方法:采用柱色谱手段,结合波谱方法(MS,NMR)分离鉴定高山绚孔菌子实体的化学成分.结果:从高山绚孔菌的氯仿提取物和醋酸乙酯提取物中分离得到11个单体化合物,分别为麦角甾醇过氧化物(1),麦角甾-7,22-二烯-3β-醇(2),啤酒甾醇(3),麦角甾醇(4),麦角甾-7,22-二烯-3-酮(5),阿里红酸A(6),硫色多孔菌酸(7)(4E,8E)-N-D-2'-羟基棕榈酰-1-O-β-D-吡喃葡萄糖基-9-甲基-4,8-sphingadienine(8),N-(2'-羟基二十四碳酰基)-1,3,4-三羟基-2-氨基-十八烷(9),烟酸(10)和齿孔酸(11).结论:化合物3,5,6,8～10首次从该真菌中分离得到.
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不同加工方法对猪苓药材质量的影响
目的:研究不同加工方法对猪苓药材质量的影响,为建立该药材的合理产地加工方法提供参考.方法:采用晒干、阴干、不同温度烘干共10种加工方法处理猪苓药材,参照2015年版《中国药典》中水分、折干率、总灰分、酸不溶性灰分含量测定方法测定;利用苯酚-硫酸法显色,紫外-可见分光光度法(检测波长625 nm)测定猪苓总多糖含量;运用HPLC测定麦角甾醇的含量,流动相甲醇,检测波长283 nm.结果:不同加工方法处理的猪苓药材性状差异较小,有效成分含量存在显著性差异,40℃以上烘干处理获得的猪苓折干率较大,水分含量较小;40,50℃烘干处理时总灰分和酸不溶性灰分含量较低,麦角甾醇和总多糖含量较高.结论:综合分析药材有效成分含量、生产成本等因素,猪苓产地加工方法以低温40,50℃烘干法为宜.
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识别真假猪苓
猪苓又名豕零、野猪食，为多孔菌科植物猪苓的干燥菌核，南方全年皆可采收，北方多在夏、秋两季采收。野生猪苓隐生于地下，地上无苗，故寻找比较困难。据有经验的药农介绍，凡生长猪苓的地方，其土壤肥沃，发黑，雨水渗透也快，小雨过后地面仍显干燥，现在猪苓已能够人工培养栽种。挖出猪苓后去掉泥沙，晒干即可入药。猪苓性平，味甘淡，入脾、肾、膀胱经，含有麦角甾醇、生物素、糖类和蛋白质等成分，具有利尿渗湿的功效，用于治疗小便不利、水肿胀满、脚气、泄泻、淋浊、带下等症，为“渗湿气，利水道，分解阴阳之的药也。（《本草汇言》）”市场上有以某种植物的菌核冒充猪苓，使用时注意鉴别。
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RP-HPLC测定人工虫草和天然虫草中麦角甾醇含量
目的：建立反相高效液相色谱法测定人工虫草和天然虫草中麦角甾醇的含量。方法采用Diamonsil C18(2)色谱柱(150 mm×4.6 mm,5μm),流动相为甲醇-水(98∶2),检测波长280 nm,柱温25℃,流速1.0 mL/min。结果麦角甾醇进样量在0.1977～3.9549μg 范围内与峰面积呈良好线性关系(r＝1.000),平均加样回收率为99.51%,RSD＝0.56%(n＝9)。结论本方法操作简便、灵敏、准确,具有良好的重复性和稳定性,适用于人工虫草和天然虫草中麦角甾醇的含量测定。
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超临界CO_2萃取灵芝子实体中麦角甾醇的实验研究
目的:探讨超临界CO_2流体萃取灵芝子实体中麦角甾醇的可行性.方法:用HPLC测定麦角甾醇的含量,采用正交试验优化超临界CO_2流体萃取灵芝子实体中麦角甾醇的工艺条件.结果:超临界CO_2流体萃取麦角甾醇的佳工艺条件:萃取压力20 MPa,萃取温度45℃,夹带剂(95%乙醇)用量为1.0 mL·g~(-1),萃取时间1.5 h.结论:超临界CO_2流体具有极性可调的优势,可有效萃取灵芝中的麦角甾醇.
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猴头菌醇提浸膏和水提浸膏甾醇类化合物的比较研究
目的:研究猴头菌甾醇类化合物,探讨醇提和水提浸膏疗效差异的药化基础.方法:利用GC-MS方法对猴头菌甾醇类物质组成进行分析,并采用气相色谱、反相HPLC及其他生化分析手段比较了猴头菌及其2种方法提取物的成分.结果:醇提浸膏较水提浸膏在粗多糖、水溶性蛋白、脂肪酸方面没有明显优势,但醇提与水提浸膏在甾醇类物质含量上存在显著差异.在猴头菌丝体中存在含量较高的不同双键形式的麦角甾醇类化合物、β-谷甾醇和4个双键的C28甾醇化合物.结论:猴头菌甾醇类化合物主要存在于醇提浸膏中,其中麦角甾醇含量高.同时首次发现猴头菌含有麦角甾-8(14)-烯-3β-醇、β-谷甾醇和4个双键的C28甾醇化合物.
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人工蛹虫草子实体化学成分研究
目的:研究人工蛹虫草子实体的化学成分.方法:大孔吸附树脂和硅胶色谱柱分离纯化,根据理化性质和波谱数据鉴定结构.结果:分离鉴定了9个化合物,分别为:麦角甾-4,6,8(14)-四烯-3-酮(1),柠檬甾二烯醇(2),二十四烷酸单甘油酯(3),麦角甾醇(4),麦角甾醇过氧化物(5),麦角甾-7,22-二烯-3β,5α,6β-三醇(6),虫草素(7),腺苷(8),N-(2-羟乙基)腺苷(9).结论:化合物1～3,6,9均为首次从该种真菌子实体中分离得到.
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白头翁汤正丁醇提取物抑制白念珠菌细胞膜
该文探讨白头翁汤正丁醇提取物(butyl alcohol extract of Baitouweng decoction,BAEB)对白念珠菌细胞膜的抑制作用.以Spot assay观察BAEB对白念珠菌细胞活性的影响;酶标仪检测BAEB干预后白念珠菌细胞内渗透压变化;荧光显微镜观察BAEB对白念珠菌细胞膜通透性的影响;高效液相检测白念珠菌细胞膜麦角甾醇的含量;qRT-PCR法检测细胞膜麦角甾醇生物合成相关基因的表达.结果显示,256,512,1 024 mg·L-1BAEB干预下白念珠菌活性逐渐降低;512,1 024 mg·L-1BAEB组白念珠菌胞内甘油含量显著性增多(P<0.05),与白念珠菌胞内渗透压相关的基因HOG1分别下调9.1,9.3,5.5倍;512,1 024 mg·L-1BAEB组白念珠菌红色荧光细胞明显增多;1 024 mg·L-1BAEB干预后麦角甾醇峰面积为35.884 95,有显著性差异(P<0.05);1 024 mg·L-1BAEB干预组ERG1,ERG2,ERG3,ERG4,ERG5,ERG6,ERG10,ERG11,ERG13,ERG24,ERG25,ERG251,ERG26与UPC2 分别下调6.58,4.89,4.15,9.24,3.41,9.84,3.08,7.50,5.53,5.90,2.45,3.25,1.98,10.07倍.BAEB可通过抑制麦角甾醇及其生物合成相关基因的表达,进而抑制白念珠菌细胞膜完整性.
关键词： 白头翁汤正丁醇提取物 白念珠菌 细胞膜 麦角甾醇 -
黄连解毒汤联合氟康唑对耐药白念珠菌麦角甾醇的影响
目的:探讨黄连解毒汤乙酸乙酯提取物(ethyl acetate extract of Huanglian Jiedu decoction,EAHD)联合氟康唑(fluconazole,FLZ)对耐药白念珠菌生物膜麦角甾醇的影响.方法:采用CLSI M27-A3的微量稀释法测定EAHD与FLZ对白念珠菌FLZ耐药株的MIC与SMIC80;棋盘稀释法测定EAHD与FLZ联用对白念珠菌的协同效应;稀释涂布平板法考察EAHD与FLZ联用不同时间对菌体的杀伤作用;分别用HPLC和qRT-PCR法检测耐药白念珠菌生物膜麦角甾醇含量及相关基因的变化.结果:对于9株白念珠菌FLZ耐药株,EAHD对其MIC介于156～1 250mg· L-1,FLZ对其MIC介于256～2048 mg· L-1以上,二者联用后MIC显著降低,FICI(部分抑菌浓度指数)低达0.066;EAHD单用对其SMIC80均高于1 250 mg·L-1,FLZ单用对其SMIC80均高于512 mg·L-1,高可达2048 mg·L-1以上,联用组除个别组具有相加作用外也均有协同效应.时间杀菌(time kill,TK)实验显示当作用12 h,二者联用杀菌效应强.HPLC结果显示联用组、EAHD组与空白组麦角甾醇量相比,分别降低了近85％,50％.qRT-PCR检测FLZ组ERG1,ERG2,ERG6,ERG7,ERG11均上调,ACS1,ACS2,MET6均下调;EAHD组所有基因均下调;联用组ERG2,ERG6,ERG11均显著上调,ERG1,ERG7,ACS1,ACS2,MET6均显著下调.结论:EAHD协同FLZ抗白念珠菌耐药株,可能与抑制麦角甾醇合成相关基因的表达来降低麦角甾醇的合成有关,造成细胞膜损伤,抑制菌体生长.
关键词： 黄连解毒汤乙酸乙酯提取物(EAHD) 耐药白念珠菌 生物膜 协同作用 麦角甾醇 -
黄苞大戟化学成分研究
对黄苞大戟Euphorbia sikkimensis地上部分的化学成分进行研究.应用硅胶,Sephadex LH-20,RP-18等色谱技术进行分离纯化,采用NMR等谱学方法鉴定结构.从黄苞大戟地上部分的90％乙醇提取物的乙酸乙酯萃取物中分离得到16个化合物,分别鉴定为柚皮素(1)、山柰酚(2)、槲皮素(3)、山柰酚-3-O-α-L-吡喃阿拉伯糖苷(4)、槲皮素-3-O-α-L-吡喃阿拉伯糖苷(5)、槲皮素-3-O-(2”-没食子酰基)-α-L-吡喃阿拉伯糖苷(6)、麦角甾醇过氧化物(7)、豆甾-5-烯-7-羰基-3β-甾醇(8)、3β-羟基-4α,14α-二甲基-5α-麦角甾醇-8,24(28)-二烯-7-酮(9)、β-谷甾醇(10)、10-葫芦二烯醇(11)、茛菪亭(12)、没食子酸乙酯(13)、对羟基苯甲醛(14)、3-羟基苯乙醇(15)、2,4-二羟基-6-甲氧基苯乙酮(16).所有化合物均为首次从黄苞大戟中分离得到,其中化合物1,4～8,15为首次从大戟属植物中分离得到.
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灵芝中麦角甾醇的提取工艺
灵芝Ganoderma lucidum(Fr.) Kart在我国有悠久的药用历史,可用于慢性支气管炎、消化不良、神经衰弱、冠心病、肝炎、高血脂、高血压、白细胞减少症等多种疾病的治疗,一直是研究的热点[1,2].
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伏立康唑长期应用可致黑素瘤
伏立康唑属三唑类(广谱)抗真菌药,通过抑制真菌中由细胞色素P450介导的14α-甾醇去甲基化,使真菌细胞膜麦角甾醇的生物合成受阻,用于曲霉属、镰刀菌属和足放线病菌属等引起的严重感染.伏立康唑治疗时耐受性一般良好,常见的不良反应包括外周性水肿、头痛、呼吸功能紊乱、视觉障碍、胃肠不适(恶心,呕吐,腹泻)、皮疹.国外报道在前期临床试验中,约有2%的患者可出现皮肤反应,包括光敏反应、唇炎和干燥症.随后又有伏立康唑可致严重光敏反应、加快皮肤光老化、假迟发性皮肤卟啉症和侵袭性鳞状细胞癌(SCC)的报告.2010年1月18日美国<皮肤病学文献>(Archives of Dermatology) 在线发表的一项观察报告表明,2例患者出现原位黑素瘤与长期应用伏立康唑相关.
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加压溶剂提取-高效液相色谱法测定天然和人工虫草中的麦角甾醇、核苷及其碱基
目的建立同时测定虫草中麦角甾醇、核苷及其碱基含量的简便方法.方法正交法优化加压溶剂提取条件;HPLC法同时测定天然和人工虫草中上述成分的含量.结果以甲醇为提取溶剂,提取温度160℃,提取时间5 min,提取压力10 MPa,循环1次,提取1次.采用Zorbax NH2分析柱(250 mm×4.6 mmID,5 μm),流动相为A(乙腈)-B(10 mmol·L-1醋酸铵溶液)二元梯度洗脱:0-5.0 min,B%为0→15%;5.0-25.0 min,B%为15%→20%;25.0-35.0 min,B%为20%→40%;35.0-45.0 min,B%为40%→80%;45.0-50.0 min,B%为80%.结论本法能够快速、简便地测定虫草中麦角甾醇、核苷及其碱基的含量.
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利用反义RNA技术抑制酿酒酵母羊毛甾醇合酶基因的表达
羊毛甾醇合酶催化的2,3-氧化鲨烯环化是麦角甾醇和三萜类化合物生物合成分支形成的关键位点,下调2,3-氧化鲨烯流向麦角甾醇的代谢途径可促进其流向三萜类化合物的代谢途径.有鉴于此,本研究根据酿酒酵母羊毛甾醇合酶基因(lanosterol synthase gene,erg7)序列设计引物,扩增5’长片段(包括erg7基因5'非编码区启动子序列和部分编码区序列)、5’短片段(包括erg7基因5’非编码区部分启动子序列和部分编码区序列)和erg7基因编码区片段,分别将其反向克隆到表达载体pESC-URA上,构建反义表达质粒.用反义表达质粒转化酿酒酵母INVSc1,在营养缺陷型培养基SD-URA上筛选重组菌株.通过半定量PCR进行检测,结果表明:与INVScl相比,转入erg7基因编码区反义片段的重组菌株内羊毛甾醇合酶基因表达量没有显著变化,而转入5'长反义片段和5'短反义片段的重组菌株内羊毛甾醇合酶基因表达量明显降低.通过TLC和HPLC方法比较麦角甾醇含量,结果表明:与INVSc1相比,转入5’短反义片段和erg7基因编码区反义片段的重组菌株内麦角甾醇含量没有显著变化,而转入5’长反义片段的重组菌株内麦角甾醇含量明显降低.本研究利用反义RNA技术抑制酿酒酵母中羊毛甾醇合酶基因的表达,为应用合成生物学技术在酿酒酵母中组建三萜类化合物代谢途径奠定了基础.
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酿酒酵母羊毛甾醇合酶基因单倍体缺陷型突变株的构建
羊毛甾醇合酶基因(lanosterol synthase gene,erg7)编码的羊毛甾醇合酶是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)甾醇生物合成途径中重要的限速酶.酿酒酵母固有的甲羟戊酸(MVA)/麦角甾醇代谢途径的中间体2,3-氧化鲨烯也是三萜类化合物的合成前体.因此,羊毛甾醇合酶催化的2,3-氧化鲨烯环化是麦角甾醇和三萜类化合物生物合成分支形成的关键位点.下调2,3-氧化鲨烯流向麦角甾醇的代谢,可为应用合成生物学技术在酿酒酵母中组建三萜类化合物的代谢途径奠定基础.本研究通过设计含有与erg7基因ORF序列两侧同源的长引物,以质粒PUG66为模板进行PCR,构建带有loxP-Marker-loxP的erg7基因敲除组件,采用LiAc/SS CarrierDNA/PEG方法转化双倍体野生型酿酒酵母INVScl,通过同源重组的方式构建酿酒酵母erg7基因单倍体缺陷型突变株.半定量PCR和实时定量PCR结果表明,突变株内erg7基因表达水平下降约1倍.TLC和HPLC结果表明,突变株内麦角甾醇含量下降至野生型菌株的42％.
