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云南省人乳头状瘤病毒16型E6/E7基因的变异分析
研究人乳头状瘤病毒16型E6和E7基因在云南省的变异情况.采集获得2 000例妇科门诊样品,提取DNA,以MY09/MY11为外引物,GP5+/GP6+为内引物,采用nest-PCR法对样品HPV-DNA高变区L1区的相应基因进行扩增、测序和分型,筛选得到20例HPV-16型病毒DNA,对其进行E6和E7基因特异性扩增,测序.结果显示20例HPV 16型E6基因中有10例在178位核苷酸发生碱基突变,突变频率为50％,E7基因中有10例在647位核苷酸发生碱基突变,突变频率为50％.进化树分析结果表明在云南省流行的HPV-16型中主要为亚洲变异型,没有发现非洲1型,非洲2型.
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人乳头瘤病毒16型修饰后E6E7基因免疫原性增强
利用突变修饰后消除转化活性并保留抗原性的中国山东地方株人乳头瘤病毒16型(human papillomavirus type 16, HPV16)E6E7融合基因(fmE6E7), 研制治疗HPV16 相关疾病的DNA疫苗.用PCR扩增fmE6E7基因后,插入真核表达质粒获得pVR1012-fmE6E7,瞬时转染Cos-7细胞,免疫荧光法检测证实其表达后,在C57BL/6小鼠后腿肌肉进行裸DNA免疫,51Cr释放法体外分析免疫鼠的细胞毒性T淋巴细胞活性(cytotoxic T lymphocyte, CTL),间接ELISA法检测免疫鼠血清中E7特异性抗体.研究表明修饰后的中国地方株E6E7融合基因可诱导机体产生特异的抗体反应和CTL反应,与单独野生型E7基因免疫相比,E6E7融和基因可更好的活化CTL反应.表明修饰后消除转化活性的中国地方株E6E7融合基因可作为HPV16治疗性DNA疫苗的靶基因.
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修饰后中国山东地方株HPV16 E6E7基因的转化活性检测及免疫原性研究
目的利用突变修饰后消除转化活性并保留抗原性的中国山东地方株人乳头瘤病毒16型(HPV16)E6E7基因, 研制HPV16 DNA疫苗. 方法定点突变E6的终止密码,并保证E7读码框架不变;定点突变E7蛋白的Rb结合区中对其转化活性维持起关键作用的第24位氨基酸.突变修饰后的基因命名为fmE6E7.PCR扩增fmE6E7,重组入pLNCX载体,脂质体法转染3T3细胞,免疫荧光组织化学及Western blot检测转染细胞蛋白的表达.经软琼脂集落培养法和BALB/c裸鼠皮下接种法检测fmE6E7的转化活性.然后PCR扩增fmE6E7,构建pVR1012-fmE6E7真核表达质粒,于C57BL/6小鼠肌肉内直接进行裸DNA免疫,51Cr释放法体外分析免疫鼠的细胞毒性T淋巴细胞活性,间接ELISA法检测免疫鼠血清中E7特异性抗体. 结果测序证实获得了预期的突变结果.pLNCX-fmE6E7转染细胞体外软琼脂培养3周未见集落形成;裸鼠皮下接种2月后未见移植瘤形成(0/3).免疫鼠获得了较好的E7特异性的抗体E和抗原特异性的CTL. 结论修饰后E6E7基因可融合表达,转化活性消除的同时还可诱发特异的细胞免疫和体液免疫,表明中国山东地方株的E6E7基因可作为HPV16治疗性DNA疫苗的靶基因.
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全酿酒酵母HPV16-E7疫苗的构建及免疫原性研究
目的 构建人乳头状瘤病毒16型(HPV16)E7重组全酿酒酵母疫苗,评价疫苗的免疫效应.方法 将HPV16 E7 cDNA亚克隆入酵母表达载体pYES2/NT,重组质粒转化酿酒酵母,经诱导表达、热灭活制备全酵母HPV16-E7疫苗,免疫C57BL/6小鼠.ELISA、MTT、LDH法分别检测疫苗诱导的细胞因子、脾淋巴细胞增殖和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答水平.结果 全酵母疫苗能够有效表达HPV16-E7 蛋白;疫苗小鼠免疫,能够刺激脾淋巴细胞增殖,并诱导出Th1型细胞因子和特异性CTL杀伤效应;免疫效果优于单纯HPV16 -E7蛋白免疫(P<0.01).结论 全酵母疫苗既能表达HPV16-E7 蛋白,又能有效诱导特异性CTL免疫应答.研究结果 为进一步进行疫苗抗肿瘤疗效研究,提供了实验基础.
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人乳头瘤病毒16型E6E7基因协同共激活分子B7-1基因免疫诱导的特异性免疫反应
目的利用突变修饰后的中国山东地方株人乳头瘤病毒16型(humsan papillomavirus type 16,HPV16)E6E7融合基因(fmE6E7),研究治疗HPV16感染相关疾病的DNA疫苗,并进一步探索利用共激活分子B7-1基因,研究更加活化细胞免疫的加强疫苗.方法将用PCR法扩增获得fmE6E7基因插入真核表达质粒pVR1012中获得pVR1012-fmE6E7,瞬时转染Cos-7细胞,免疫荧光组织化学法检测证实其表达后,在C57BL/6小鼠肌肉内进行pVR1012-fmE6E7单独免疫,或与小鼠共激活分子B7-1基因真核表达质粒(pcDNA3.1-B7-1)联合免疫.51Cr释放法分析免疫小鼠的细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocytes,CTL)活性,间接ELISA法检测小鼠血清中E7特异性抗体.用5×105个C3细胞皮下接种C57BL/6小鼠,分析小鼠体内诱发的特异性抗瘤免疫水平.结果修饰后的E6E7基因免疫可诱导机体产生特异的抗体反应和CTL反应,小鼠B7-1基因与fmE6E7联合免疫可显著提高特异性CTL活性,并可保护33%(2/6)的小鼠免受C3肿瘤细胞的攻击,而单独fmE6E7基因免疫则不能抑制C3瘤细胞的生长,联合B7-1基因免疫对诱发的抗体水平无加强作用.结论中国山东地方株E6E7融合基因可用于DNA疫苗的构建,B7-1基因协同免疫可提高疫苗的细胞免疫水平,利用B7-1基因作为HPV16 DNA疫苗的协同因子具有重要价值.
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人乳头瘤病毒16型早期基因E7的克隆及其在原核细胞中的表达
目的进一步研究与宫颈癌密切相关的人乳头瘤病毒16型(HPV16)E7基因的生物学活性.方法采用PCR法从中国妇女宫颈癌标本中扩增HPV16早期基因E7,测序分析其DNA的序列.结果克隆的HPV16E7基因与标准型进行比较表明,前者无核苷酸突变.将此基因装入原核表达载体,能在E.Coli中高效表达出谷胱甘肽S-转移酶(GST)-E7蛋白.Western印迹分析表明,此融合蛋白能与E7抗体特异地结合.结论克隆的HPV16E7基因及其表达的蛋白可为今后分子流行病学调查及疫苗研制提供有用的资料.
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人乳头瘤病毒58型治疗性复合DNA疫苗载体的构建
目的:构建和表达人乳头瘤病毒(Human papilloma virus,HPV)58型相关宫颈癌治疗用 PVAX1-HPV58mE6E7Fc-hIL12复合DNA疫苗载体.方法:将HPV58mE6E7融合基因片段插入真核表达载体pCI-Fc-GPI中,构建重组真核表达质粒pCI-sig-HPV58mE6E7-Fc-GPI.再将得到的sig-HPV58mE6E7-Fc-GPI片段插入新型疫苗载体PVAX1-IRES-hIL12中,构建PVAX1-HPV58mE6E7Fc-hIL12复合DNA疫苗载体,流式细胞术、免疫荧光及ELISA分别检测该疫苗载体的表达.结果:经限制性内切酶鉴定及测序分析证实PVAX1-HPV58mE6E7Fc-hIL12复合DNA疫苗载体构建成功.流式细胞术、免疫荧光及ELISA检测表明该疫苗载体中的融合抗原sig-HPV58mE6E7-Fc-GPI及分子佐剂人白介素12(hIL12)能够同时实现真核表达.结论:PVAX1-HPV58mE6E7Fc-hIL12复合DNA疫苗载体可作为治疗HPV58相关肿瘤及其癌前病变的候选疫苗载体.
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真核细胞内外源性HPV16 E7癌基因表达及其对cdc25A及Cyclin E表达的影响
背景与目的:人乳头状瘤病毒(HPV)感染及其引发的抑癌基因功能丧失和细胞周期调控失调是宫颈癌发病的重要因素.HPV16诱发宫颈癌的机制主要与其两个早期开放读码框架E6、E7转化基因密切相关.HPVE6、E7引起细胞生长和增殖异常,同时伴有Cyclin A、Cyclin D1、CDK4等细胞周期蛋白的表达异常.本研究采用体外基因转染技术将HPV 16 E7基因转入靶细胞,通过对目的基因瞬时表达的检测,进而观察在E7病毒癌蛋白的影响下调控G1/S检验点的几种细胞周期调节蛋白的表达,以探讨HPV16型E7基因外源性表达对子宫颈癌HeLa细胞细胞周期调节因子cdc25A及细胞周期蛋白E(Cyclin E)的影响.方法:从宫颈癌标本中经PCR扩增回收HPV16E7基因片段,将其插入腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV,与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1构建重组腺病毒基因组Ad-E7.用脂质体介导Ad-E7导入包装细胞人胚肾细胞系HEK-293细胞,包装出完整腺病毒颗粒.测定病毒上清液滴度,感染体外培养的HeLa细胞.采用RT-PCR方法检测转染前后HeLa细胞cdc25A的mRNA表达的差异;激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)检测转染前后Cyclin E表达的差异.结果:荧光显微镜下,转染后HEK-293细胞和HeLa细胞表达绿色荧光蛋白.RT-PCR结果显示转染后,HeLa细胞cdc25A的mRNA含量较转染前显著增加[感染前灰度值0.23±0.10,感染后0.87±0.22(P＜0.01)],LSCM检测结果显示转染后Cyclin E表达较转染前明显增加.结论:重组腺病毒可以成功介导外源性HPV16E7基因在HeLa细胞内表达,HPV16E7基因促进HeLa细胞周期调节因子cdc25A和Cyclin E的表达.
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小干扰RNA抑制宫颈癌Hela细胞株HPV18 E6、E7基因的表达
目的:以人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)18型E6基因为靶点,研究小干扰RNA(small interference RNA,siRNA)对宫颈癌Hela细胞株HPV18基因组中恶性转化基因E6、E7的抑制作用及对细胞内P53蛋白表达的影响.方法:实验分细胞培养液阴性对照组(阴性对照组),无关序列siRNA对照组(无关序列对照组)及转染HPV18 E6-siRNA实验组(siRNA实验组).设计并合成HPV18 E6-siRNA及无关序列siRNA,转染Hela细胞后,RT-PCR检测转染后48、120 h细胞内HPV18 E6、E7 mRNA的变化,Western blotting检测转染后48 h细胞内HPV18 E7和P53蛋白的变化.结果:siRNA转染Hela细胞的效率约为85%.siRNA转染后48 h,实验组细胞内HPV18 E6、E7 mRNA及E7蛋白含量降低,其含量分别为阴性对照组的33.33%、36.78%及33.84%;实验组细胞内P53蛋白含量增加,其含量为阴性对照组的2.194倍.siRNA转染后120 h,实验组细胞HPV18 E6、E7mRNA含量恢复为阴性对照组的90.91%、101.60%.结论:HPV18 E6-siRNA体外能明显抑制宫颈癌Hela细胞HPV18 E6、E7基因的表达,增加细胞内肿瘤抑制因子P53蛋白的水平.
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人乳头瘤病毒E7与人干扰素α-2b融合基因在中国仓鼠卵巢细胞中的表达
目的:构建人乳头瘤病毒(HPV)11-E7及人干扰素(IFN)α-2b的真核表达载体,并在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中表达.方法:同时用Kpn Ⅰ、EcoRⅠ酶切pET-32a-IFNα-2b-linker-HPV11-E7及pcDNA3.1,将酶切产物纯化回收,两者的回收产物进行连接反应.连接产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5α,随机挑选阳性克隆并提取质粒酶切鉴定;用脂质体法转染CHO细胞,用免疫荧光法检测融合基因的表达.结果:DNA测序结果显示,成功地将IFN-α-2b-linker-HPV11-E7装入pcDNA3.1的KpnⅠ、EcoRⅠ酶切位点之间,且其序列与设计完全一致;激光扫描共聚焦显微镜观察可见目的蛋白的表达.结论:成功地构建了HPV11-E7及IFNα-2b的真核表达载体,并在CHO细胞中表达,为提高DNA疫苗免疫效果的研究奠定了基础.
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HPV11-E7与人干扰素α-2b融合表达质粒的构建及表达
目的构建HPV11-E7与人干扰素α-2b(IFNα-2b)融合基因表达载体,并进行原核表达.方法通过连接肽将HPV11-E7与人IFNα-2b连接并克隆至原核表达载体pET-32a,进行酶切鉴定及DNA序列分析.将重组质粒转染E.coli BL21,经IPTG诱导后对其表达产物进行SDS-PAGE和Westemblotting分析.结果测序结果表明将HPV11-E7和人IFNα-2b通过连接肽(G-G-S-G-S)3连接并克隆至pET-32a,且其基因序列与设计完全一致.SDS-PAGE和Western blotting分析结果均显示在相对分子质量约50 000位置可见明显蛋白条带.结论HPV11-E7与人IFNα-2b融合基因表达载体的成功构建及表达,为今后的相关实验研究奠定了基础.
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人乳头瘤病毒11型E7蛋白基因的克隆和表达
目的从尖锐湿疣皮损标本中扩增出人乳头瘤病毒11型(HPV11)E7蛋白基因,并进行表达、纯化和鉴定.方法用PCR法,从尖锐湿疣标本中扩增出HPV11 E7蛋白基因,与pGEX-6P-1载体连接成重组表达质粒pGEX-6P-1/E7;重组质粒转入BL21大肠杆菌,经诱导表达融合蛋白GST-E7;该蛋白经剪刀酶切除GST,Glutathione Sepharose 4B亲和层析柱纯化,SDS-PAGE和蛋白质印迹法检测鉴定.结果经酶切及序列分析鉴定,重组质粒pGEX-6P-1/E7成功构建,诱导后高表达GST-E7融合蛋白并得到纯化,蛋白质印迹证实表达蛋白为E7蛋白.结论获得高表达、高纯度的HPV11E7蛋白,为该蛋白的功能及免疫学分析及尖锐湿疣疫苗研究打下了基础.
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宫颈癌组织中HPV16型E6/E7序列突变分析
目的 分析泉州地区宫颈癌患者HPV16型E6/E7序列突变情况,探讨其与宫颈癌发生的相关性.方法 取35例HPV16阳性的宫颈癌组织标本,采用PCR法扩增E6、E7全长基因.PCR产物直接测序,并与野生型序列进行比对.分析E6、E7基因的变异情况.结果 E6、E7基因的突变率分别为91.4％和89.2％.E6基因中有10个位点为错义突变,2个位点为无义突变.氨基酸突变频率高的是D25E(77.1％).E7基因中共发现5个突变位点,有2个位点为错义突变,3个位点为无义突变,突变频率高是N29S和无义突变T846C(均为75.0％).结论 HPV16 E6、E7基因中常见突变位点D25E、N29S和T846C可能与宫颈癌的发生密切相关,可为研究针对中国人群的HPV疫苗提供一定的线索.
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14例人乳头状瘤病毒16型E7基因结构和变异分析
目的：分析江西地区宫颈癌患者HPVl 6型E7序列突变情况，探讨其与宫颈癌发生的相关性。方法用棉拭子擦去宫颈口多余分泌物,用取样刷置于宫颈口顺时针方向旋转5～6周以获取足量的宫颈脱落上皮细胞。提取组织DNA，用HPVl6 E6特异性引物进行PCR扩增，对扩增的基因片段进行测序分析。结果在HPV16 E7基因核苷酸及氨基酸序列变异中鳞癌有6例、CINⅢ6例和CINⅡ2例，鳞癌和CINⅢ12例都有氨基酸错意突变，尤以A647G A646C C790T多见。结论表明这一地区HPVl6、A647G、A646C、C790T变异可能与宫颈癌的发生密切相关，可能提示为致癌预警信息，为HPV基因变异与宫颈癌的关系研究提供更完善的理论依据。
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rBCG-HPV16L1-E7疫苗的构建和免疫原性研究
[目的]构建以BCG为载体的rBCG-HPV16L1-E7疫苗,研究rBCG-HPV16L1-E7重组表达体嵌合乳头状瘤病毒样颗粒(VLPs)对小鼠免疫功能的影响,初步评价此疫苗对HPV相关肿瘤(宫颈癌)的预防作用.[方法]电穿孔法将pIJ702-HPV16L1-E7分泌型穿梭表达质粒导入BCG中表达,构成rBCG-HPV16L1-E7疫苗.Western blot检测E7蛋白的表达.采用rBCG-HPV16L1-E7疫苗皮下注射于C57BL/6小鼠,51Cr释放法体外分析免疫鼠的细胞毒性T淋巴细胞活性(cytotoxic T lymphocyte,CTL),ELISA法检测免疫鼠血清中E7特异性抗体和细胞因子的表达水平.[结果]Western blot法分析证实,该重组疫苗能特异地表达HPV16 E7蛋白.以rBCG-HPV16L1-E7免疫小鼠后,检测到的细胞因子IL-2、IFNγ及E7抗体的含量明显升高,诱导机体产生特异的抗体反应以及CTL反应.[结论]rBCG-HPV16L1-E7能增强小鼠的细胞和体液免疫反应,可作为HPV16预防性疫苗.
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外源性人乳头瘤病毒16型E7癌基因导入对HeLa细胞cdc25A表达的影响
目的:研究HPV16型E7病毒癌基因感染对人宫颈癌HeLa细胞周期调节因子cdc25A mRNA表达的影响,探讨E7癌基因和cdc25A在宫颈癌发生发展中的作用.方法:用含有HPV16E7病毒癌基因的重组腺病毒载体感染体外培养的人宫颈癌HeLa细胞.采用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测感染前后HeLa细胞cdc25A mRNA表达的差异.结果:感染后HeLa细胞cdc25A的mRNA含量较感染前显著增加(感染前灰度值0.2306±0.0964,感染后0.8739±0.2188,P＜0.01).结论:HPV16E7癌基因促进细胞周期调节因子cdc25A的表达,可能是宫颈癌发病机制中的重要分子事件.
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扬州地方株HPV16 E7基因的克隆及序列分析
目的:了解扬州地区HPV16E7基因结构特点.方法:从感染HPV16的宫颈癌组织中提取DNA,用PCR技术获得HPV16E7基因,以pGEM-Teasy为克隆载体构建重组质粒pGEM-T-E7,进行限制性核酸内切酶及核苷酸序列分析.结果:扬州地方株HPV16E7基因与已报道的标准株(德国)仅在核苷酸序列上有一处突变,即199位的T→C,密码子由TTG变为CTG,而氨基酸序列未发生改变;与其他国家报道的HPV16E7核苷酸序列也存在一定差异,但同源性均在98.7%以上.结论:扬州地方株HPV16E7基因的成功克隆,将丰富我国HPV16感染的流行病学资料,为HPV疫苗研制奠定基础.
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人乳头瘤病毒11型早期蛋白E6和E7基因的克隆及序列分析
目的:从尖锐湿疣(CA)标本中克隆出人乳头瘤病毒11型(HPV 11)早期蛋白E6、E7基因,并进行序列测定及编码氨基酸序列分析,为HPV感染的检测和基因工程疫苗研究奠定基础.方法:用PCB法,从CA标本中扩增出HPV11 E6、E7基因,与载体pGEX-6P-1连接成重组质粒pGEX-6P-1/E6、pGEX-6P-1/E7,酶切鉴定及双脱氧法测序观察其变异状况.结果:克隆出HPV 11早期蛋白E6、E7基因,成功构建重组质粒pGEX-6P-1/E6、pGEX-6P-1/E7.本研究克隆出的HPV11 E7基因与GenBank标准株序列完全相同,E6基因有两个位点的变化.结论:本研究克隆出的HPV11 E6、E7基因与标准株基本相同,这将为进一步研究E6、E7基因的表达、免疫活性及流行病学奠定基础.
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携带HPV16 E7病毒癌基因的重组腺病毒穿梭质粒的构建及鉴定
①目的构建携带人乳头瘤病毒16型(HPV16)E7病毒癌基因的复制缺陷型重组腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV-E7.②方法应用PCR技术从宫颈癌组织中扩增E7病毒癌基因全长片段,并导入T载体进行测序,与Nucleotide中HPV16标准毒株序列比较鉴定.目的基因及穿梭质粒载体pAdTrack-CMV分别经Bgl Ⅱ和Hind Ⅲ双酶切后连接,转化宿主菌E.coli DH5α,应用PCR法及限制性内切酶消化法双重鉴定重组质粒,并测序.③结果 PCR扩增产物与Nucleotide中HPV16 E7序列一致,重组穿梭质粒经Bgl Ⅱ和Hind Ⅲ双酶切后电泳,可观察到9 220 bp大小的载体条带和313 bp大小的目的基因条带;将经PCR和双酶切鉴定的重组阳性克隆测序,结果证实克隆成功.④结论成功地构建了携带HPV16 E7基因的重组腺病毒穿梭质粒.
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HPV16E6和E7基因序列多态性与宫颈癌临床病理特征相关性
目的 探讨宫颈癌人乳头瘤病毒16型(HPV16)E6和E7转化基因序列多态性,及其与宫颈癌临床病理特征的相关性.方法 从77例宫颈癌组织中筛选出51例HPV16阳性标本,扩增E6及E7基因,PCR产物进行序列测定.应用DNAStar生物软件进行核苷酸和氨基酸序列的分析.结果 宫颈癌组织中HPV16 E6共测得6个突变位点,均为错义突变;常见的突变位点为T178G/A(D29E),突变频率为56.00%,T178G/A突变在不同分化程度、不同分期、不同肿瘤大小及有无淋巴结转移组的分布频率差异无显著性(P＞0.05).宫颈癌组织中HPV16 E7共测得4个突变位点,2个为错义突变;常见的突变位点为A647G(N29S),突变频率为68.09%,A647G在中分化及低分化组的突变频率分别为56.67%、88.24%,两组间突变频率差异有显著性(x2=4.98,P＜0.05);A647G在不同分期、不同肿瘤大小、有无淋巴结转移组的分布频率差异无显著性(P＞0.05).结论 青岛地区HPV16 E6基因T178G/A突变与宫颈癌的发生发展无关,HPV16 E7基因A647G突变与宫颈癌的分化程度呈负相关,可以作为评估宫颈癌恶性程度的指标.
