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子宫颈炎症对宫颈上皮内瘤样变患者疾病转归的影响
目的 对比人乳头瘤病毒16型(HPV16)感染阳性和HPV感染阴性的宫颈上皮内瘤样病变(cervical intraepithe-lial neoplasia,CIN)患者2年间复查资料,探讨在HPV自然清除时间内子宫颈炎症反应对CIN病情发展的影响.方法 选取2011-2016年广东省韶关市粤北人民医院和肇庆市第一人民医院CIN患者300例(HPV16阳性和HPV阴性各150例)作为研究对象,以宫颈薄层液基细胞学筛查和阴道镜下宫颈组织活检两种方法确诊CIN,HPV16检测采用PCR-反向斑点杂交法;2年间复诊患者阴道分泌物直接涂片镜检法进行白细胞(WBC)计数,采用“WBC计数均值”指标反映炎症情况.结果 WBC计数均值1.0～1.4、1.5～1.9、2.0～2.4、2.5～2.9、3.0～3.4,3.5～3.9、4.0～4.5各区间,HPV阳性组疾病恶化率分别为0(0/13)、11.1％ (2/18)、23.3％(7/30)、32.5％(13/40)、50.0％(14/28)、72.2％(13/18)、66.7％(2/3)[总体恶化率为34.0％(51/150)];HPV阴性组疾病恶化率分别为0(0/17)、0(0/17)、0(0/23)、5.4％(2/37)、6.4％(2/31)、13.3％(2/15)、30.0％(3/10)[总体恶化率为6.0％(9/150)].总体看,WBC计数均值越高,两组CIN发生恶化比率越高,并且HPV阳性组疾病转归更差(HPV阳性组:x2=35.82,P＜0.01;HPV阴性组:x2=17.25,P＜0.01).但WBC计数均值各区间两组转归情况对比均有差异.结论 宫颈炎症情况对CIN患者疾病转归有影响,炎症反应程度高,疾病转归不良;HPV感染与炎症情况对疾病转归可能存在协同作用.
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细胞外信号调节激酶1/2表达与HPV16感染及其交互效应在子宫颈癌变中的作用
目的 探讨细胞外信号调节激酶(p-ERK)1/2表达与HPV16感染在子宫颈癌变中的作用及其交互效应.方法 选取2013年9月至2014年3月在山西省肿瘤医院、山西省妇幼保健院、山西省晋煤集团总医院经组织病理学确诊的正常子宫颈(NC)女性34例、低度子宫颈上皮内瘤变(GIN Ⅰ)患者26例、高度子宫颈上皮内瘤变(CINⅡ/Ⅲ)患者57例和子宫颈鳞状细胞癌(SCC)患者59例为研究对象.采用调查问卷收集研究对象的人口学特征和子宫颈癌相关因素等资料,并采集子宫颈组织标本.采用PCR法检测HPV16感染状况,应用免疫组化法检测子宫颈组织中磷酸化ERK 1/2 (p-ERK1/2)蛋白的表达情况.同时使用ERK抑制剂U0126对子宫颈癌细胞Siha(HPV 16阳性)和C33A(HPV阴性)进行抑制,比较抑制前后细胞的增殖、凋亡情况.结果 随着子宫颈癌变的进展,HPV16感染率(趋势x2=17.99,P＜0.001)和p-ERK 1/2的表达率(趋势x2=10.58,P=0.001)均逐渐升高,HPV 16感染与p-ERK1/2蛋白表达在CIN Ⅰ、CINⅡ/Ⅲ、SCC组中均存在正相加交互作用.细胞实验结果显示,ERK抑制后,Siha和C33A细胞均表现为增殖能力降低(Siha:t=6.863,P＜0.001;C33A:t=7.092,P＜0.001)、凋亡率增高(Siha:t=-5.201,P=0.006;C33A:t=-4.335,P=0.005).ERK抑制后HPV16阳性Siha细胞较HPV阴性C33A细胞增殖指数高(t=7.066,P＜0.001)、凋亡率低(t=-2.431,P=0.057).结论 p-ERK1/2高表达和HPV16感染均可增加子宫颈癌变风险,两者在子宫颈癌变中存在正相加交互作用.在子宫颈癌细胞增殖凋亡过程中,ERK1/2的活化可能对HPV16感染细胞的作用更为显著.
关键词： 宫颈肿瘤 人乳头瘤病毒16 细胞外信号调节激酶1/2 交互作用 -
陕西省人乳头瘤病毒基因分型检测分析
目的 研究陕西地区妇女人群人乳头状瘤病毒(human papillomavirus,HPV)感染状况,为宫颈癌防治提供参考依据.方法 收集2012年1月至2013年5月在陕西省肿瘤医院就诊、筛查和体检的7 640例宫颈脱落细胞标本,采用PCR体外扩增和DNA反向点杂交相结合的DNA芯片技术,对宫颈脱落细胞标本进行HPV基因分型检测.结果 调查对象年龄为(42.26±19.15)岁,共检出HPV阳性者1 441例,总感染阳性率为18.86％(1 441/7640),其中高危型感染阳性率为16.03％(1 225/7640,包括多重高危感染),低危型感染阳性率为4.88％(373/7 640,包括多重低危感染)；高低危混合感染阳性率为2.05％(157/7640).在被检测的18个高危HPV亚型中,常见类型依次为HPV16(34.70％,523/1 507)、HPV58(11.48％,173/1 507)、HPV18(7.43％,112/1 507)、HPV33(7.10％,107/1 507)、HPV56 (6.04％,91/1 507)和HPV52 (5.51％,83/1 507)型,HPV39型感染表率低,仅为0.59％(9/1 507),未检测出HPV82型；在被检测的5个低危HPV-DNA亚型中依次为HPV43(38.13％,151/396)、HPV42(22.22％,88/396)、HPV81 (20.45％,81/396)、HPV6(11.87％,47/396)和HPV11 (7.32％,29/396)型.不同年龄段人群HPV阳性率差异有统计学意义(P＜0.01),其中41 ～50岁年龄段人群HPV检出率高,为23.23％(749/3 224).HPV阳性者中单一亚型检出率75.71％(1 091/1 441),单一高危型检出率为61.35％ (884/1 441)；单一高危感染占单一感染81.03％ (884/1 091).多重检出率为24.29％ (350/1 441),以二重感染为常见(18.18％,262/1 441),其中以二重高危感染多达151例(10.48％)；二重感染占多重感染74.86％ (262/350)；三重及四重以上检出率分别占多重感染20.29％ (71/350)和4.89％ (17/350).在各年龄段妇女人群中,41 ～50岁年龄段单一感染检出率为17.80％ (574/3 224),高于其他组别,差异有统计学意义(x2 =20.18,P＜0.05).结论 陕西地区高危型HPV感染以HPV16、58、18、33、56和52型感染比较常见,低危亚型以HPV43、42型比较常见.HPV感染高发年龄段为41 ～50岁女性.
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北京市宫颈癌筛查妇女中高危型HPV感染状况及在宫颈癌前病变中的分布
目的 了解北京市宫颈癌筛查妇女中感染高危型HPV感染状况及在宫颈癌前病变中的分布.方法 2014年1月至2015年3月,以前往北京市宫颈癌筛查机构接受宫颈癌免费筛查的35~64岁妇女为研究对象,采用分层整群随机抽样法,从中抽取31091名妇女,接受妇科检查、高危HPV分型检测,其中HPV16/18型以外的其他高危型阳性者接受宫颈细胞学检测;HPV16/18型阳性者、宫颈细胞学检测不明意义的非典型鳞状细胞(ASCUS)及以上者,妇科宫颈检查发现可疑异常者转诊阴道镜检查,阴道镜检查结果可疑或异常者进行组织病理学检查.分析不同特征研究对象高危型HPV感染情况、宫颈癌及癌前病变检出率.结果 31091名研究对象的年龄分布为35~64岁,35~49岁年龄组人数占44.3%(13780名),50~64岁年龄组人数占55.7%(17311名);农村妇女占66.1%(20536名).高危型HPV总感染率为7.4%(2305例),其他高危型感染率为5.7%(1758例),混合感染检出率为1.5%(477例).45~49、50~54岁者的感染率较高,为7.8%(463例)、7.9%(1044例)(χ2=14.07,P=0.015).城市妇女高危型HPV感染率为6.2%(507例),农村妇女为7.9%(1798例)(χ2=25.75,P<0.001).HPV16型感染者占17.0%(391例),HPV18型占6.9%(161例),HPV52型、HPV51型、HPV58型感染者分别占8.6%(20例)、5.2%(12例)、7.7%(18例).宫颈癌及癌前病变检出率为395.6/10万(123例).在高级别病变中,HPV16和18型感染占60.5%(72例).50~54岁者HPV16型感染率及高级别病变检出构成比均较高,分别为(1.5%,107例)(χ2=11.54,P=0.042).结论 北京市35~64岁妇女常见高危型HPV感染型别依次为HPV16、18、52、51和58型.HPV16和18型在高级别病变中的感染率较高.50~54岁者HPV16型感染率及高级别病变检出率较高.
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2014-2016年深圳市子宫颈癌筛查中HPV阳性者HPV高危亚型分布及相关因素
目的 分析深圳市参与子宫颈癌筛查的HPV阳性者感染高危亚型HPV状况及相关因素.方法 通过深圳市妇幼保健管理系统子宫颈癌防治信息平台选取2014—2016年参加子宫颈癌筛查且HPV检测阳性者为研究对象,共10624例,收集其基本信息和HPV基因亚型检测结果,根据致病性不同分为:高危型共15种,包括HPV 16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66和68;低危型共6种,包括HPV 6、11、42、43、44和81.采用多因素非条件logistic回归模型分析发生高危型HPV感染的相关因素.结果 本研究中HPV检测阳性者均接受HPV基因亚型检测,年龄为(38.08±9.38)岁,其中高危型感染为9979例,占93.9%;2014—2016年HPV高危型感染比例分别为91.5%(2769例)、93.8%(2785例)和95.6%(4425例)(P趋势<0.001).与25岁及以下者相比,26~30、31~35、36~40、41~45、≥50岁年龄组发生高危型HPV感染的OR(95%CI)值分别为1.67(1.20~2.31)、1.49(1.09~2.03)、1.71(1.23~2.37)、1.65(1.19~2.31)和1.84(1.26~2.67);与已婚者相比,未婚者发生高危型HPV感染的OR(95% CI)值为0.71(0.50~1.00);与2014年相比,2015和2016年感染高危型HPV的OR (95%CI)值分别为1.43(1.17~1.74)和2.03(1.68~2.46).常见的5种HPV感染亚型均为高危型,依次是HPV52(25.1%,2670例)、HPV16(19.2%,2041例)、HPV58(13.3%,1413例)、HPV18(9.9%, 1048例)和HPV51(9.3%,993例).结论 年龄、婚姻状况、筛查年份是深圳市女性高危型HPV感染的相关因素.除HPV16和18型感染外,HPV52、58、51型感染也应受到重视.
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原核高效制备人乳头瘤病毒16型L1病毒样颗粒
目的通过原核表达系统高效制备人乳头瘤病毒（HPV）16晚期蛋白 L1病毒样颗粒（VLPs）。
方法构建 HPV16L1基因序列优化前后的 PET30a-HPV16L1重组质粒，转化大肠杆菌 Rosetta(DE3)；用 IPTG诱导目的基因表达，两步层析方法纯化 HPV16L1蛋白；电镜下观察纯化产物形成 VLPs 的情况。
结果成功构建大肠杆菌工程菌，高效可溶表达（目的蛋白约占总蛋白的38%）并纯化 HPV16L1蛋白，纯度达95%以上，电镜下观察，发现纯化后的目的蛋白为直径50 nm 左右，形态与天然病毒颗粒高度相似。
结论在大肠杆菌原核系统中高效、简易地制备了 HPV16L1 VLPs，为诊断试剂和疫苗的研制奠定基础。 -
p16/Ki-67双染检测在意义不明的不典型鳞状细胞分流诊断中的应用
目的 探讨p16/Ki-67双染检测在宫颈细胞学意义不明的不典型鳞状细胞(ASC-US)分流中的意义.方法 收集2015年3月至2016年1月液基薄层细胞学检查(TCT)诊断为ASC-US的患者样本,TCT检查后6周内进行了阴道镜检查及活检的患者共171例,对其细胞学剩余标本进行p16/Ki-67双染检测,其中90例ASC-US患者同时进行了高危型HPV检测.结果 171例标本中p16/Ki-67双染检测的阳性率为43.9%(75/171),发现宫颈上皮内瘤样病变2级及以上(简称CIN2+,包括CIN2、CIN3和宫颈癌)的灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值分别为77.6%(52/67)、77.9%(81/104)、69.3%(52/75)和84.4%(81/96);而高危型HPV检测发现CIN2+的灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值分别为100.0%(34/34)、10.7%(6/56)、40.5%(34/84)和6/6.p16/Ki-67双染检测的灵敏度低于高危型HPV检测,但特异度明显更高.结论 p16/Ki-67双染检测能够保持较高的灵敏度,并有更高的特异度,是分流ASC-US的良好方法.
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子宫颈上皮内瘤变及鳞状细胞癌组织cyclin D1表达特征及其与HPV16 E7表达的相关性分析
目的 探讨cyclin D1在宫颈上皮内瘤变及鳞状细胞癌中的表达及其与HPV16 E7基因表达的相关性.方法 SiHa、Hcc94细胞均为宫颈上皮来源的鳞癌细胞,其中Hcc94细胞的E6/E7基因缺失.采用即时荧光定量PCR、免疫组织化学法检测cyclin D1在子宫颈上皮内瘤变(CIN)及鳞状细胞癌组织中基因及蛋白的表达情况;采用逆转录PCR(RT-PCR)、Western blot、免疫组织化学方法检测cyclin D1在不同E7表达状态的鳞状细胞癌细胞系的表达情况;设计靶向HPV16 E7基因启动子区的siRNA序列,构建质粒转染SiHa细胞,筛选稳定沉默E7基因的细胞系命名为cm-16细胞株;将空质粒转染SiHa细胞,获得空质粒细胞系命名为B3细胞株.用RT-PCR和Western blot检测E7沉默cm-16细胞cyclin D1基因及蛋白表达情况.结果 cyclin D1仅在正常宫颈鳞状上皮副基底细胞中表达,在CIN1、CIN2、CIN3表达降低,在HPV阳性的宫颈鳞状细胞癌中阴性或少量点灶状表达;cyclin D1在E7阳性SiHa细胞中的表达水平较cm-16及Hcc94细胞减低(均P＜0.05).结论 E7高表达的子宫颈癌组织及细胞中cyclin D1低表达,HPV E7基因抑制子宫颈癌cyclin D1表达.
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表没食子儿茶素没食子酸酯对人宫颈癌细胞生长抑制作用及作用途径的探讨
目的 探讨表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)对人乳头瘤病毒(HPV)呈阳性表达的宫颈癌CaSki细胞与HeLa细胞的生长抑制作用及其作用途径.方法 在CaSki细胞与HeLa细胞的培养液中添加EGCG后,应用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测两种宫颈癌细胞的生长曲线;4',6-联脒-2-苯基吲哚(DAPI)荧光标记法观察细胞凋亡的形态学变化;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测病毒致癌基因E6(HPV E6)、雌激素受体α(Era)、雌激素受体B(Erβ)、芳香化酶等蛋白的表达水平.结果 MTT法显示,培养液内添加EGCG能明显抑制CaSki细胞与HeLa细胞的生长,并且呈浓度和时间依赖性;DAPI荧光标记法显示,25 μmol/L EGCG作用CaSki细胞和50μmol/L EGCG作用HeLa细胞24 h后均呈典型的细胞凋亡形态学改变;Western blot法显示,25μmol/L EGCG作用CaSki细胞和50μmoL/LEGCG作用HeLa细胞12、24、48 h后,HPV E6、Erα、芳香化酶的蛋白表达量逐渐减低,ERB的蛋白表达量增加,与对照组相比有统计学差异(P<0.05).结论 EGCG在体外能有效抑制人宫颈癌CaSki细胞与HeLa细胞的生长与增殖并诱导其凋亡,其作用机制可能与下调HPV E6、Erα、芳香化酶蛋白的表达量、上调Erβ的蛋白表达量有关.
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单纯HPV16/18阳性行阴道镜检查有可疑病变患者的子宫颈组织病理检查结果分析
目的 分析单纯HPV16型和(或)18型(HPV16/18)阳性行阴道镜检查并有可疑病变患者的子宫颈组织病理检查结果,探讨HPV16/18阳性患者直接行阴道镜检查在子宫颈病变早期诊断中的意义.方法 收集2014年1月至2016年1月在首都医科大学附属北京朝阳医院妇产科阴道镜门诊就诊的年龄为21~65岁、HPV16/18阳性、细胞学检查结果为阴性或未明确诊断意义的不典型鳞状上皮细胞(ASCUS)、阴道镜检查有可疑病变的患者,收集其子宫颈组织的病理检查结果进行回顾性分析.共有337例患者纳入本研究,其中细胞学检查结果为阴性者214例,为ASCUS者123例.结果(1)337例患者中,子宫颈组织的病理检查结果为子宫颈炎症63例(18.7%)、子宫颈上皮内瘤变(CIN)Ⅰ89例(26.4%)、CINⅡ~Ⅲ及子宫颈原位腺癌(AIS)182例(54.0%)、早期(指Ⅰa1期)子宫颈癌3例(0.9%).其中CINⅡ及以上子宫颈病变(包括CINⅡ~Ⅲ、AIS、早期子宫颈癌)所占比例,细胞学检查结果为ASCUS的患者(71.5%,88/123)明显高于细胞学检查结果为阴性的患者(45.3%,97/214;χ2=24.876,P<0.01);HPV16型阳性患者(64.4%,150/233)明显高于HPV18型阳性患者(30.3%,27/89;χ2=31.388,P<0.01);不同年龄段[20~29岁为69.3%(52/75)、30~39岁为55.1%(75/136)、40~49岁为44.8%(30/67)、≥50岁为47.5%(28/59)]患者间比较,差异也有统计学意义(χ2=16.512,P=0.032).(2)在细胞学检查结果为阴性的患者中,HPV16型阳性患者的CINⅡ及以上病变所占比例高于HPV18型阳性患者[分别为54.8%(80/146)、26.0%(20/27);χ2=16.930,P<0.01];在细胞学检查结果为ASCUS的患者中,HPV16型阳性患者的CINⅡ及以上病变所占比例也明显高于HPV18型阳性患者[分别为76.5%(78/102)、55.6%(15/27);χ2=4.642,P=0.031].(3)与炎症和CINⅠ患者比较,CINⅡ及以上子宫颈病变患者的HPV16型阳性率高、HPV18型阳性率低、ASCUS的发生率高、年龄小、产次少,两组间上述指标分别比较,差异均有统计学意义(P<0.05);进一步采用二分类变量logistic回归法进行多因素分析显示,HPV16型阳性、细胞学检查结果为ASCUS是预测CINⅡ及以上病变发生的独立危险因素(P<0.01).结论 在HPV16/18阳性患者中,CINⅡ及以上子宫颈病变所占比例高,其中HPV16型阳性比HPV18 型阳性患者更易发生 CINⅡ及以上子宫颈病变.HPV16/18 阳性患者直接行阴道镜检查并对有可疑病变者行子宫颈组织病理检查有助于早期发现子宫颈病变.
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HPV16 L1基因3'端和LCR基因甲基化与其致病性的关系
目的 定位、定量检测位于HPV16 L1基因3’端和LCR基因的甲基化位点的甲基化水平,了解HPV16甲基化与其致病性的关系.方法 选择HPV16阳性的无宫颈病变携带者、宫颈上皮内瘤变(CIN)患者和宫颈癌患者各30例,分别命名为携带组、CIN组、宫颈癌组,使用宫颈液基细胞学检查后剩余的细胞提取DNA,经处理后,扩增HPV16 L1基因3’端和LCR基因,采用焦磷酸测序技术检测HPV16 L1基因3’端和LCR基因的21个位点的甲基化状况,比较每个位点的甲基化水平是否存在差异.结果 位于E6/E7启动子的5个位点31、37、43、52、58均存在随病情进展甲基化水平逐渐降低的趋势,宫颈癌组患者的甲基化水平低(分别为21.86％、28.15％、21.37％、26.15％、15.48％),分别比较,差异均有统计学意义(P＜0.01).位于L1基因3’端的7032、7091、7136 3个位点的甲基化水平在携带组、CIN组和宫颈癌组患者间比较,差异有统计学意义(P均＜0.01)；7032、7091位点携带组的甲基化水平低(分别为2.71％、6.95％),宫颈癌组甲基化水平高(分别为18.89％、27.72％);7136位点CIN组患者的甲基化水平高(66.45％),宫颈癌组次之(46.43％),携带组低(34.85％).结论 HPV16 L1基因3’端及E6/E7启动子甲基化位点的甲基化水平存在显著性差异,HPV16甲基化状况有可能预测宫颈癌癌前病变或宫颈癌的发生.
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子宫颈基底样鳞癌的临床病理分析
目的 探讨子宫颈基底样鳞癌(BSCC)的临床和病理特点.方法 对2013年3月—2018年7月解放军总医院病理科诊断的10例子宫颈BSCC患者的临床病理资料进行回顾性分析.结果 (1)临床特点:子宫颈BSCC患者的发病年龄为35～69岁,中位年龄51岁,其中5例为绝经后妇女;临床表现多为阴道异常流血(7例).10例子宫颈BSCC患者中,5例有HPV检查结果者均为HPV阳性,其中3例为高危型HPV阳性(包括2例HPV 16型阳性);10例患者均行阴道镜检查,其中3例为外生结节状肿物,3例为内生浸润型肿物,4例会诊患者的肿物类型不详;临床分期:5例为Ⅰb1期,1例为Ⅱa期,4例会诊患者的临床分期不详.(2)治疗:10例患者中,8例行子宫全切除+双侧附件(或输卵管)切除+盆腔淋巴清扫术,其中6例术后辅以放疗或化疗;2例仅行放、化疗.(3)病理特点:镜下观,子宫颈BSCC由胞质稀少、核深染的基底样细胞构成,肿瘤呈实性巢团状或岛状,细胞异型性明显,核分裂象多见,细胞巢周围的肿瘤细胞呈栅栏状排列,部分细胞巢的中央可见粉刺样坏死.子宫颈BSCC与普通型鳞癌、鳞状上皮内病变混合存在.10例患者中,6例有免疫组化法检测结果,主要表达p16及鳞癌的标志物如p63、细胞角蛋白(CK)5/6、p40蛋白,其阳性表达率分别为3/3、3/3、2/2、3/3;少数表达CK7蛋白,其阳性表达率为1/3.(4)预后:随诊时间为1周～64个月,失访2例;8例随访患者中,3例出现髂骨、肺或皮肤的转移,5例随访期内无复发、转移.结论 子宫颈BSCC是少见的子宫颈恶性肿瘤,与高危型HPV感染有关,p16蛋白呈阳性表达;治疗与子宫颈鳞癌相似,根据临床分期行手术治疗联合放、化疗的综合治疗.目前认为该病变具有较强的侵袭性,患者预后欠佳.
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趋化因子受体7与人乳头瘤病毒在宫颈癌及其癌前病变的相关性研究
目的 探讨趋化因子受体(CXCR)7与人乳头瘤病毒(HPV)-16、-18在宫颈癌及其癌前病变中的相关性.方法 选择2011年3月至2013年3月在珠海市人民医院进行手术治疗时切除组织经病理学检查确诊为宫颈癌的59例患者(纳入宫颈癌组),确诊为宫颈上皮内瘤变(CIN)的86例患者(纳入CIN组),以及因其他疾病切除正常子宫颈的20例患者(纳入对照组)为研究对象.采用免疫组织化学链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结(SP)法检测3组患者宫颈组织的CXCR7表达水平及其阳性率.采用实时定量PCR方法检测3组患者宫颈组织中HPV-16、-18 DNA表达量.采用Western blotting方法检测3组患者宫颈组织中CXCR7和基质细胞衍生因子(SDF)-1蛋白表达量,并进行CXCR7表达量和HPV-16、-18 DNA表达量的相关性分析.3组患者的年龄等基本临床资料比较,差异无统计学意义(P＞0.05).结果 ①宫颈癌组及CIN组患者宫颈组织中,CXCR7阳性率均显著高于对照组,并且差异有统计学意义(x2=37.77,P＜0.001;x2 =6.68,P=0.010).②HPV-16 DNA在CIN Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和宫颈癌组织中的表达量,分别为对照组宫颈组织的(1.50±0.05)倍、(2.87±0.09)倍、(3.17±0.12)倍与(6.41±0.20)倍;在CINⅢ和宫颈癌组织中,HPV-16DNA表达量显著高于对照组,并且差异有统计学意义(t=2.15,P=0.042;t=3.11,P=0.003).HPV-18 DNA在CIN Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和宫颈癌组织中的表达量,分别是对照组宫颈组织中的(1.56±0.07)倍、(2.45±0.11)倍、(3.89±0.16)倍与(6.12±0.17)倍;在CINⅢ和宫颈癌组织中,HPV-18DNA表达量显著高于对照组,并且差异有统计学意义(t=2.21,P=0.024;t=3.03,P=0.004).③Western blotting检测结果表明,SDF-1和CXCR7随着宫颈组织病变程度的加深,其表达量随之上升,并且CXCR7表达量与HPV-16、-18 DNA表达量均呈正相关关系(r=0.74、0.78,P＜0.001).结论 CXCR7可能促进高危型HPV引起宫颈癌的进程.
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CRISPR/Cas系统干扰HPV16 E6基因对SiHa细胞增殖和凋亡影响
目的 研究人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV) 16型的E6病毒癌基因被特异性靶向HPV16-E6位点成簇的、规律间隔的短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)定点敲除后,宫颈癌细胞系SiHa在细胞凋亡和增殖方面的变化.方法 设计靶向HPV16 E6基因的向导RNA(guide RNA,gRNA),脂质体介导gRNA质粒和Cas9质粒对HPV16阳性人宫颈癌细胞系SiHa和HPV16阴性的正常人胚肾上皮HEK293细胞转染.流式细胞术检测SiHa和HEK293细胞转染前后细胞在凋亡率方面的变化;CCK8法检测转染前后两种细胞的增殖能力变化;蛋白质印迹法检测E6基因敲除后,SiHa细胞中E6蛋白和p53蛋白的表达水平.结果 将靶向HPV16 E6基因的gRNA质粒和Cas9质粒共同转染SiHa细胞48 h后,E6-gRNA/Cas9组SiHa细胞凋亡率为25.6％,与未转染gRNA和Cas9质粒的SiHa细胞空白组(2％)以及只转染等量Cas9质粒的Cas9组(3％)相比明显上升,差异有统计学意义,F=58.500,P＜0.001;而只转染等量Cas9质粒的Cas9组和空白组SiHa细胞的凋亡率差异无统计学意义,P＞0.05.CCK8实验表明,转染72 h后,与空白组相比,E6-gRNA/Cas9组SiHa细胞增殖抑制率为31.3％,细胞增殖抑制明显,P=0.008;转染96 h后,与空白组相比,E6-gRNA/Cas9组细胞增殖抑制率为30.6％,P=0.002;而不表达HPV16 E6基因的HEK293细胞的增殖能力未被抑制,3组细胞之间增殖能力相比差异无统计学意义,F=0.219,P=0.810.转染48 h后,与空白组相比,SiHa细胞E6蛋白表达下降,E6蛋白表达抑制率为-45.24％,三组之间E6蛋白表达量差异有统计学意义,F=30.392,P＜0.001;与空白组相比,p53蛋白表达上调+250.08％,3组p53蛋白表达量差异有统计学意义,F=50.530,P＜0.001.结论 应用CRISPR特异性地抑制HPV16 E6基因表达可以诱导SiHa细胞凋亡,抑制SiHa细胞增殖,下调E6蛋白并且上调p53蛋白表达.
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乳腺癌患者中人乳头瘤病毒16和 Epstein-Barr病毒感染的初步研究
目的探讨人乳头瘤病毒16(HPV16)和Epstein-Barr病毒(EBV)在不同病理类型乳腺癌及乳腺良性病变中的表达。方法采用PCR方法对2013年6月至2014年6月本院收治的90例不同病理类型的乳腺癌(40例浸润性导管癌、30例浸润性小叶癌,20例原位癌)、20例乳腺纤维瘤以及10例乳腺正常组织标本HPV16的E6基因位点和EBV的内部重复序列BamHIW区域进行扩增,并采用免疫组织化学方法对上述标本进行HPV16和EBV潜在膜蛋白( LMP-1)染色,以判断标本是否有HPV16及EBV感染,计算病毒检出率。比较不同病理类型乳腺癌的病毒检出率及比较PCR、免疫组织化学两种方法对乳腺组织标本病毒感染的检出率有无差异采用χ2检验。不同病理类型的乳腺癌标本中HPV16及EBV阳性细胞率的比较选用方差分析以及Bonferroni两两比较。结果 PCR结果显示：HPV16病毒检出率在乳腺癌标本为44.44%(40/90),乳腺纤维瘤标本为5%(1/20),正常乳腺组织为0；EBV的病毒检出率在乳腺癌标本中为43.33%(39/90),乳腺纤维瘤标本及正常乳腺组织均为0。在不同病理类型乳腺癌中,HPV16和 EBV 的病毒检出率差异均无统计学意义(χ2=1.238,P=0.539；χ2=1.867,P=0.393)。免疫组织化学结果显示：HPV16病毒检出率在乳腺癌标本为42.22%(38/90),乳腺纤维瘤标本为5%(1/20),正常乳腺组织为0；EBV病毒检出率在乳腺癌标本为42.22%(38/90),乳腺纤维瘤标本及正常乳腺组织均为0。有HPV16病毒感染的乳腺癌组织标本中,HPV16阳性细胞率在浸润性导管癌为(29.78±0.38)%,浸润性小叶癌为(28.31±0.53)%,原位癌为(51.83±0.65)%,3组比较差异有统计学意义(F=537.779,P=0.000)；有 EBV 病毒感染的乳腺癌组织标本中,EBV 阳性细胞率分别为(29.73±0.51)%、(28.14±0.65)%及(51.11±0.68)%,3组比较差异有统计学意义(F=427.771,P=0.000)；原位癌标本中,HPV16和EBV的阳性细胞率均显著高于其他两种病理类型的乳腺癌( P均=0.000)。两种方法对乳腺癌标本 HPV16及 EBV 的检出率差异不具有统计学意义(χ2=0.090, P=0.764；χ2=0.023,P=0.880)。结论 HPV16和EBV两种病毒的感染与乳腺癌的发生可能有一定的关系,其感染程度可能与乳腺癌的病理类型有关。
关键词： 乳腺肿瘤 人乳头瘤病毒16 Epstein-Barr病毒 -
人乳头瘤病毒16型转化基因在不同阶段宫颈上皮病变组织中的分布及基因变异特点
目的 研究人乳头瘤病毒(HPV)16 E6、E7和E5基因在湖北地区不同阶段宫颈上皮病变患者组织中的分布以及E6、E7基闪的变异特点.方法 从124例宫颈癌、17例宫颈上皮内瘤变(CIN) Ⅰ+CINⅡ级、23例CIN Ⅲ级和36例慢性宫颈炎患者活检或手术切除标本中提取组织DNA,用HPV16 E6、E7和E5特异性引物进行PCR扩增,对部分扩增的 E6 和 E7 产物片段进行测序分析.结果 在官颈炎、CIN Ⅰ+CINⅡ级、CINⅢ级和宫颈癌组织中,E6基因的阳性率分别为25.0%、29.4%、60.9%和76.6%;E7基因的阳性率分别为16.7%、41.2%、43.5%和61.3%:E5 基因的阳性率分别为5.6%、5.9%、30.4%和40.3%.E6、E7和E5基因在不同阶段宫颈上皮病变组织中的阳性率差异均有统计学意义(均P<0.01).在80例官颈癌测序组织中,有47例发生E6基因178位点的T→C突变,突变率为58.8%,相应氨基酸由天冬氨酸(Asp)改变为谷氨酸(Glu);而在20例宫颈炎和22例CINⅠ～Ⅲ级测序组织中,E6基因178位点的突变率分别为25.0%和31.8%.在30例宫颈癌测序组织中,有21例发生E7基因647位点的A-G突变,突变率为70.0%,相应氨基酸由天冬酰胺(Asn)改变为丝氨酸(Ser);而在20例宫颈炎和22例CINⅠ～Ⅲ级测序组织中,E7基因647位点的突变率分别为35.0%和40.9%.结论 HPV16 E6、E7和E5基因与宫颈癌的发生和发展有高度的相关性.但E5基因在不同阶段官颈上皮病变中可能存在不同程度的缺失.中国湖北地区流行的HPV16病毒株可能为HPV16亚洲型变异株.
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新疆不同民族头颈部鳞状细胞癌组织中人乳头瘤病毒的感染情况及病毒载量分析
人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)感染已被证明是宫颈癌的一个重要病因[1].近年来,越来越多的研究表明,HPV高危型(16/18亚型)感染与头颈部鳞状细胞癌密切相关[2-4].因种族、文化、社会经济及地域差异,头颈部肿瘤的发病率存在很大差异.白种人患者感染HPV的概率是黑种人的10倍[5].由于HPV的感染存在着较明显的种族差异,我们利用逆转录聚合酶链反应(reverse transcriptasepolymerase chain reaction,RT-PCR)技术检测新疆维吾尔族、哈萨克族、汉族头颈部鳞状细胞癌中HPV感染情况,探讨新疆不同民族间头颈部鳞状细胞癌中HPV感染差异.
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人乳头瘤病毒16型融合蛋白的大肠杆菌高效表达及对肿瘤生长的抑制作用
目的 在原核表达系统高效表达人乳头瘤病毒(HPV) 16型L2N120E7E6融合蛋白,获得具有高表达水平和强免疫原性的HPV治疗性融合蛋白疫苗.方法 利用重叠PCR方法构建经密码子优化的HPV16L2N120E7E6融合基因,然后将其插入pET9a原核表达载体中,采用Western blot 法对表达蛋白进行鉴定.对HPV16L2N120E7E6融合蛋白免疫的小鼠进行特异性抗体和细胞免疫反应的检测,评价其对肿瘤生长的抑制作用.结果 密码子优化的HPV16L2N120E7E6基因能在原核表达载体pET9a中高效表达,表达水平约占全菌蛋白的48.6％.HPV16L2N120E7E6融合蛋白免疫的小鼠可检测到针对L2、E7和E6的高滴度抗体,抗体滴度分别为1:40317、1:16000和1:800.CPG1826佐剂和HPV16L2N120E7E6融合蛋白免疫小鼠后,可产生较强的针对HPV16E749-57肽特异性T细胞免疫反应和较弱的E6特异性T细胞免疫反应,其分泌γ-干扰素的效应T细胞斑点数分别为(464.00±35.52)个和(47.00±11.67)个.HPV16L2N120E7E6融合蛋白对小鼠移植瘤生长有明显的抑制作用,有80.0％(8/10)的小鼠不成瘤.结论 HPV16L2N120E7E6融合蛋白可作为治疗HPV16慢性感染和宫颈癌手术后辅助治疗的候选疫苗.
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cobas4800高危型人乳头瘤病毒检测技术在子宫颈癌前病变筛查和细胞学转诊中的应用
目的 评价cobas 4800高危型人乳头瘤病毒(HPV)检测技术用于细胞学转诊和子宫颈癌前病变筛查的可行性和可靠性.方法 670例研究对象来自于参加子宫颈癌筛查或医院门诊健康检查的妇女,均经病理和细胞学诊断.采用cobas 4800 HPV检测技术和第2代杂交捕获法(HC-2)平行检测子宫颈脱落细胞标本,比较两种方法的一致性；采用HPV PCR检测(HybriBio)和基因测序分型,比较检测HPV16和HPV18的一致性.以病理诊断结果作为金标准,评估cobas 4800 HPV检测技术和HC-2筛查子宫颈上皮内瘤变(CIN)2级阳性的灵敏度和特异度.结果 cobas 4800 HPV检测技术与HC-2总符合率为89.40％(Kappa=0.778),阳性符合率为86.42％,阴性符合率为91.36％；cobas 4800 HPV检测技术与HybriBio筛查HPV16总符合率为88.89％(Kappa=0.777),筛查HPV18的符合率为94.94％(Kappa=0.753),阳性符合率分别为98.91％和100.00％,阴性符合率分别为78.41％和94.44％；以基因测序和HybriBio结果为标准调整,调整后的HPV高危型阳性符合率为100％,阴性符合率为94.42％；HPV16和HPV18阳性符合率均为100％,阴性符合率分别为82.35％和94.44％.cobas 4800 HPV检测技术筛查CIN2的灵敏度和特异度分别为91.07％和70.97％,而HC-2分别为93.75％和71.33％,差异无统计学意义(P＞0.05).结论 cobas 4800 HPV检测技术能够有效的检测HPV16、HPV18和其他高危型HPV病毒,有较高的筛查灵敏度和特异度.
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人类子宫颈癌基因、p16及人乳头瘤病毒16/18在子宫颈癌中表达的意义
目的 研究人类子宫颈癌基因(HCCR)、p16在子宫颈上皮内瘤变(CIN)及子宫颈癌中的表达,探讨其与人乳头瘤病毒(HPV)16/18感染的相关性及其临床意义.方法 采用免疫组织化学SP法检测28例慢性子宫颈炎,62例CIN I～Ⅱ级、49例CIN Ⅲ级及52例子宫颈癌组织中p16、HCCR蛋白的表达,并采用原位杂交法检测其HPV16/18的表达.结果 HCCR在慢性子宫颈炎、CIN I～Ⅱ级、CINⅢ级和子宫颈癌组的阳性表达率分别为3.57%(1/28)、35.48%(22/62)、61.22%(30/49)和88.46%(46/52),各组间两两比较,差异有统计学意义(P<0.05).p16蛋白的阳性表达率从慢性子宫颈炎、CIN I～Ⅱ级、CINⅢ级到子宫颈癌组逐渐增加,分别为7.14%(2/28)、33.87%(21/62)、65.30%(32/49)和92.31%(48/52),各组间两两比较差异均有统计学意义(P<0.05);HPV16/18在慢性子宫颈炎、CIN I～Ⅱ级、CIN Ⅲ级和子宫颈癌组的阳性率分别为10.71%(3/28)、40.32%(25/62)、69.39%(34/49)和84.62%(44/52),除子宫颈癌与CIN Ⅲ级比较差异无统计学意义外(P=0.115),其余组间两两比较,差异有统计学意义(P<0.01).p16、HCCR的表达与HPV16/18感染呈正相关(P<0.01).结论 HPV感染可能通过影响p16及HCCR蛋白的过表达与子宫颈癌及其癌前病变的发生、发展密切相关,三者联合检测对子宫颈癌及癌前病变的筛查和预防具有重要意义.
