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HCMV感染对宫颈癌细胞Siha发生上皮—间质转化的作用
目的 研究人巨细胞病毒(HCMV)感染对宫颈癌细胞Siha发生上皮—间质转化的作用及意义. 方法 实验组用HCMV AD169(MOI=5)和5 ng/ml TGF-[31作用宫颈癌Siha细胞,同时将仅TGF-β1作用的Siha细胞作为对照组,分别在0、24、48、72 h观察细胞形态的变化,应用RT-PCR检测E-钙粘蛋白和波形蛋白的转录水平,采用Western blot检测E-钙粘蛋白、波形蛋白和MMP-2的表达水平. 结果 实验组细胞于48 h发生细胞形态学的变化,早于对照组的72 h;实验组上皮细胞标记物E-钙粘蛋白的转录和表达水平较对照组显著下调(P＜0.01),间质细胞标记物波形蛋白的转录和表达较对照组显著上调(P＜0.01)且表达提前,MMP-2的表达较对照组显著上调(P＜0.01)且表达提前.结论 HCMV感染可促进宫颈癌细胞Siha发生化上皮—间质转化.
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CRISPR/Cas系统干扰HPV16 E6基因对SiHa细胞增殖和凋亡影响
目的 研究人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV) 16型的E6病毒癌基因被特异性靶向HPV16-E6位点成簇的、规律间隔的短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)定点敲除后,宫颈癌细胞系SiHa在细胞凋亡和增殖方面的变化.方法 设计靶向HPV16 E6基因的向导RNA(guide RNA,gRNA),脂质体介导gRNA质粒和Cas9质粒对HPV16阳性人宫颈癌细胞系SiHa和HPV16阴性的正常人胚肾上皮HEK293细胞转染.流式细胞术检测SiHa和HEK293细胞转染前后细胞在凋亡率方面的变化;CCK8法检测转染前后两种细胞的增殖能力变化;蛋白质印迹法检测E6基因敲除后,SiHa细胞中E6蛋白和p53蛋白的表达水平.结果 将靶向HPV16 E6基因的gRNA质粒和Cas9质粒共同转染SiHa细胞48 h后,E6-gRNA/Cas9组SiHa细胞凋亡率为25.6％,与未转染gRNA和Cas9质粒的SiHa细胞空白组(2％)以及只转染等量Cas9质粒的Cas9组(3％)相比明显上升,差异有统计学意义,F=58.500,P＜0.001;而只转染等量Cas9质粒的Cas9组和空白组SiHa细胞的凋亡率差异无统计学意义,P＞0.05.CCK8实验表明,转染72 h后,与空白组相比,E6-gRNA/Cas9组SiHa细胞增殖抑制率为31.3％,细胞增殖抑制明显,P=0.008;转染96 h后,与空白组相比,E6-gRNA/Cas9组细胞增殖抑制率为30.6％,P=0.002;而不表达HPV16 E6基因的HEK293细胞的增殖能力未被抑制,3组细胞之间增殖能力相比差异无统计学意义,F=0.219,P=0.810.转染48 h后,与空白组相比,SiHa细胞E6蛋白表达下降,E6蛋白表达抑制率为-45.24％,三组之间E6蛋白表达量差异有统计学意义,F=30.392,P＜0.001;与空白组相比,p53蛋白表达上调+250.08％,3组p53蛋白表达量差异有统计学意义,F=50.530,P＜0.001.结论 应用CRISPR特异性地抑制HPV16 E6基因表达可以诱导SiHa细胞凋亡,抑制SiHa细胞增殖,下调E6蛋白并且上调p53蛋白表达.
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RAGE在不同宫颈鳞癌细胞中的表达及意义
目的 探讨人宫颈鳞癌细胞中晚期糖基化终末产物受体(receptor for advanced-glycation end products,RAGE)的表达水平及定位,筛选出合适的细胞用于研究RAGE对宫颈鳞癌细胞生物学行为的影响.方法 选取人宫颈鳞癌细胞SiHa、MS751、C33-A及CaSki,采用免疫细胞化学染色检测癌细胞中RAGE蛋白的定位,应用qRT-PCR法检测癌细胞中RAGE mRNA的表达水平.应用免疫印迹法检测癌细胞中RAGE蛋白的表达水平.采用酶联免疫吸附法检测4种人宫颈鳞癌细胞分别培养至12、24、36、48及72h时,上清中分泌型RAGE蛋白的表达水平.结果 RAGE蛋白主要在人宫颈鳞癌细胞的胞质和胞膜中表达,大部分位于胞质.RAGE mRNA的表达量在SiHa细胞中高,为0.986±0.053,而在MS751细胞中的表达量相对低,仅0.111 ±0.008(P ＜0.05).RAGE蛋白在SiHa细胞中的表达量相对高的(0.982±0.096),而在MS751细胞中的表达量相对低(0.250±0.056),差异有统计学意义(P＜0.05).SiHa、MS751、C33-A及CaSki细胞各个时间点均检测到其分泌至上清中的RAGE蛋白,且4种细胞随着培养时间的延长,其分泌型RAGE的表达量逐渐增高.结论 RAGE在4种人宫颈鳞癌细胞中均有表达.C33-A和CaSki细胞适合用做后续RAGE干扰和过表达实验;SiHa细胞可在培养液中加入抗RAGE抗体改变RAGE表达量;用于后续研究RAGE对宫颈鳞癌细胞生物学行为的影响.
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鱼腥草总黄酮对人肿瘤细胞的抗肿瘤活性作用
目的 探究鱼腥草黄酮类提取物对人子宫颈癌细胞株SiHa增殖和凋亡的影响.方法 ①采用20倍60％乙醇进行回流提取,大孔树脂分离提取纯化鱼腥草中黄酮类化合物；②应用四甲基偶氮唑蓝法检测黄酮类化合物对SiHa的细胞抑制率；③采用流式细胞术检测其对SiHa细胞凋亡的影响.结果 ①鱼腥草黄酮提取物有抑制SiHa细胞生长的作用,半数抑制浓度值为0.825 g/L；②鱼腥草黄酮提取物能以浓度依赖性诱导SiHa细胞的凋亡.结论 鱼腥草黄酮提取物能抑制SiHa肿瘤细胞生长,诱导凋亡的作用,为鱼腥草的抗子宫颈癌的药效学效应提供了实验依据.
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宫颈癌细胞系中HPV病毒感染与P16和E-cadherin表达的相关性分析
目的 探讨宫颈癌细胞系中HPV感染状态与P16和E-cadherin表达之间的相关性.方法 应用免疫细胞化学染色、免疫荧光、Western-blot以及RT-PCR的方法检测HeLa、SiHa和C33A三个细胞系中P16和E-cadherin的表达情况.结果 HPV阳性的两个细胞系HeLa和SiHa中P16的表达呈强阳性而E-cadherin的表达呈弱阳性,HPV阴性的细胞系C33A中P16的表达为弱阳性而E-cadherin呈强阳性表达.结论 宫颈癌细胞系中HPV的感染与P16的表达呈正相关而与E-cadherin的表达呈负相关.
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慢病毒介导的水通道蛋白8短发卡RNA抑制SiHa人子宫颈癌细胞的迁移研究
目的 探讨慢病毒介导的AQP8短发卡RNA(short hairpin RNA,shRNA)对SiHa人子宫颈癌细胞迁移的影响.方法 2011年6月构建慢病毒介导的AQP8 shRNA稳定转染SiHa细胞系,新疆医科大学基础医学院病理教研室通过Transwell侵袭和迁移实验、损伤愈合实验及增殖和贴附能力实验检测AQP8基因沉默对SiHa细胞迁移的抑制作用.结果 (1)成功构建慢病毒介导的AQP8 shRNA稳定转染SiHa细胞系；(2)AQP8shRNA-SiHa侵袭迁移率明显低于对照组(F=196.451,P＜0.05)；AQP8shRNA-SiHa愈合速度明显低于对照组(F=37.725,P＜0.05)；AQP8shRNA-SiHa组增殖及基质贴附能力与对照组相比差异均无统计学意义(P＞0.05).结论 抑制AQP8基因表达可以抑制SiHa细胞的迁移和潜在的侵袭过程.
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紫柏凝胶抑制宫颈癌Siha细胞增殖和诱导凋亡的实验研究
目的 研究紫柏凝胶对HPV阳性宫颈癌细胞Siha的增殖抑制和凋亡诱导作用.方法 选取对数生长期Siha细胞,采用不同浓度(15、7.5、3.25 mg/mL)组,不加药物Siha细胞为对照组.MTS检测细胞生长抑制,台盼蓝染色检测细胞存活率,HOECHST 33342/PI染色法检测凋亡细胞形态学改变.结果 MTS法检测,各组紫柏凝胶对Siha细胞的生长均有不同程度的抑制作用,3.125 mg/mL剂量组与空白组相比有统计学意义(P<0.05),IC50为(15±2.1)mg/mL;台盼蓝染色,紫柏凝胶对Siha细胞生长有一定抑制作用,各浓度组细胞生长抑制率均高于对照组(P<0.05);紫柏凝胶作用Siha细胞后细胞间质变松,细胞质颗粒增多,染色质凝聚,分块,胞质浓缩;HOECHST 33342/PI染色,荧光显微镜下观察到紫柏凝胶引起细胞发生凋亡.结论 紫柏凝胶能抑制宫颈癌Siha细胞的增殖和诱导其凋亡.
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LRP16影响宫颈癌Siha细胞对化疗药物的敏感性
目的:探讨抑制LRP16的表达对宫颈癌Siha细胞的化疗药物敏感性的影响.方法:将抑制LRP16表达的小干扰RNA:negativecontrol-siRNA(NC)、siRNA-374(si374)转染入Siha宫颈鳞癌细胞系中,通过顺铂(DDP)和紫杉醇(TAX)的处理后,采用CCK-8检测不同浓度紫杉醇、顺铂作用宫颈癌细胞系Siha48h后,计算出细胞被抑制一半时顺铂、紫杉醇的药物浓度(IC50);使用Hoechst33342染色观察细胞凋亡,采用流式细胞仪检测顺铂IC50作用Siha细胞48小时后的细胞凋亡情况,紫杉醇IC50作用Siha细胞之后的细胞周期分布情况.结果:CCK-8检测转染的Siha细胞增殖活性受到抑制,Hoechst33342染色观察转染的Siha 细胞凋亡明显增加,流式细胞仪检测凋亡显示,si374+顺铂的早期凋亡率22.15±2.24,NC+顺铂12.45±2.72,流式细胞仪检测周期显示G2/M(％),si374+紫杉醇29.94±1.87,NC+紫杉醇17.66± 2.32.结论:LRP16基因表达下调之后,抑制Siha细胞的增殖、促进其凋亡,使细胞周期滞留于G2/M期,从而提高Siha细胞的化疗敏感性.
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RNAi抑制Ku80表达后促进宫颈癌SiHa细胞的放射敏感性
背景与目的:Ku80为细胞受辐射致DNA双链断裂(DNA double-strand break,DSB)后的主要修复蛋白之一,Ku80的高表达预示着宫颈癌组织对放射线的抵抗,本研究运用RNAi技术抑制Ku80表达,观察宫颈癌SiHa细胞对X线敏感性的变化.方法:构建1个靶向抑制Ku80的siRNA表达载体和1个阴性对照质粒,稳定转染入SiHa细胞后Western blot和RT-PCR检测Ku80表达变化;6 MV X线照射10 Gy后20 h、28 h和48 h收集细胞,流式细胞术检测细胞凋亡率;克隆形成实验检测细胞D0、SF2和α等值.结果:构建表达质粒转染SiHa细胞经筛选后获得2个稳定转染细胞株,Western blot和RT-PCR分析表明转染pKu80-siRNA的阳性克隆Ku80在mRNA和蛋白质水平均受到明显抑制;X线照射28 h及48 h后,Ku80表达受抑细胞其凋亡率均显著高于转染阴性质粒组和空白对照组(P＜0.05);Ku80受抑细胞的D0和SF2值分别为1.330和0.425,低于转染阴性质粒细胞(1.748和0.580)和空白对照细胞(1.835和0.597),α值为0.295,高于转染阴性质粒细胞(0.176)和空白对照细胞(0.188).结论:运用RNAi技术可以有效抑制Ku80的表达从而促进SiHa细胞对X线的敏感性,Ku80可能是一个较理想的肿瘤分子治疗靶点.
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MicroRNA下调SiHa中CD147的表达及对其肿瘤生物学活性的影响
目的:探讨下调宫颈癌细胞系SiHa中CD147蛋白表达对肿瘤细胞增殖成瘤性等生物学活性的影响.方法:构建重组质粒pSilencer 4.1-CMV neo/CD147 siRNA1、2,稳定转染至宫颈癌细胞系SiHa,采用半定量RT-PCR法、Western blot法检测干扰后细胞CD147及凋亡相关基因Bcl-2、caspase-3 mRNA及蛋白的表达;运用MTT法检测干扰后肿瘤细胞增殖变化;裸鼠成瘤实验分析肿瘤细胞CD147蛋白表达下调后的成瘤性.结果:与对照组相比,转染了pSilencer 4.1-CMV neo/CD147 SiRNA 1、2的SiHa中CD147及Bcl-2的mRNA、蛋白表达水平有显著下调,活性caspase-3表达增加,肿瘤增殖活性下降,裸鼠成瘤实验显示干扰后肿瘤细胞成瘤性及癌肿大小均低于对照组.结论:SiRNA转染能有效抑制宫颈癌细胞系SiHa中CD147的表达,且能抑制肿瘤细胞增殖能力,肿瘤的成瘤能力亦明显下降.
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晚期糖基化终末产物受体对宫颈癌细胞生物学行为的影响
目的 探讨晚期糖基化终末产物受体(RAGE)对宫颈癌SiHa细胞增殖、凋亡等生物学行为及裸鼠成瘤能力的影响及相关机制.方法 SiHa细胞分3组培养,空白对照组为仅添加凝聚胺,空载体组为添加凝聚胺+转染空载体质粒,过表达组为添加凝聚胺+转染RAGE过表达质粒.采用pLenti-C-mGFP-RAGE质粒转染方法构建RAGE基因稳定过表达的宫颈鳞癌SiHa细胞.采用Western blot法检测SiHa细胞RAGE、增殖细胞核抗原(PCNA)、B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、与Bcl-2相互作用的细胞死亡调节因子(Bim)蛋白表达水平,CCK-8法检测RAGE基因对SiHa细胞增殖的影响,流式细胞仪检测RAGE基因对SiHa细胞凋亡的影响.采用裸鼠皮下成瘤法,动态观察RAGE基因对宫颈癌肿瘤生长的影响.结果 转染pLenti-C-mGFP-RAGE质粒可明显上调SiHa细胞中RAGE蛋白的表达.过表达组SiHa细胞的增殖力均明显高于空白对照组及空载体组(均P＜0.05),而过表达组SiHa细胞的凋亡率均明显低于空白对照组及空载体组(均P＜0.05).过表达组PCNA及Bcl-2蛋白表达水平均明显高于空白对照组及空载体组(均P＜0.05),而Bax/Bcl-2表达水平均明显低于空白对照组及空载体组(均P＜0.05),3组Bax及Bim蛋白表达水平比较差异均无统计学意义(均P＞0.05).过表达组裸鼠皮下瘤体体积和瘤体质量均显著高于空载体组的体积和瘤体质量,差异均有统计学意义(均P＜0.05).结论 上调RAGE基因的表达可促进SiHa细胞增殖,抑制SiHa细胞凋亡,促进宫颈癌瘤体的生长,该作用和抗凋亡蛋白Bcl-2相关.
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AQP1和AQP3在子宫颈鳞状细胞癌中表达的研究
目的:探讨AQP1和AQP3在子宫颈癌中的表达及意义.方法:通过荧光定量PCR和免疫荧光检测AQPI和AQP3在人子宫颈癌SiHa细胞系中的表达,通过免疫组化检测AQPI和AQP3在35例维吾尔族子宫颈癌、15例CIN Ⅲ和15例慢性宫颈炎中的表达.结果:(1)SiHa细胞中AQP1和AQP3在mRNA和蛋白水平均表达;(2)AQP1表达于宫颈病变组织间质血管内皮细胞的胞质,采用微血管密度(MVD)表示AQP1表达强度.慢性宫颈炎、CIN Ⅲ和子宫颈癌组的MVD分别是43.6±17.8、56.2±11.6、70.8±21.1,宫颈癌组MVD显著高于CIN Ⅲ组及慢性宫颈炎组(P均<0.05),CIN Ⅲ和慢性宫颈炎组间差异无统计学意义;AQP3在慢性宫颈炎、CIN Ⅲ和子宫颈癌组的阳性率分别是13.33%、26.67%、48.57%,子宫颈癌组与慢性宫颈炎组间差异有统计学意义(P = 0.018),子宫颈癌组与CIN Ⅲ、CIN Ⅲ与慢性宫颈炎组间差异均无统计学意义(P均>0.05).结论:AQP1和AQP3的表达可能与子宫颈癌的发生、发展有关.
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组蛋白去乙酰化酶抑制剂联合顺铂对宫颈癌细胞化疗增敏作用的研究
目的:通过检测组蛋白去乙酰化酶抑制剂(SAHA)联合顺铂(DDP)对宫颈癌SiHa细胞生长抑制和促凋亡结果,探讨SAHA对宫颈癌细胞化疗增敏的疗效及机制.方法:将SAHA 0.25、0.5、1、2、4、6μmol/L和DDP 1、2、4、6、8、10μg/mL分别组成单药组和不同SAHA+DDP联合用药组,另设不加药对照组.MTT法检测两种药物单用及联合用药对SiHa细胞的增殖抑制作用;通过流式细胞术(FCM)观察药物对细胞周期的影响;用AnnexinV-FITC标记药物作用后的细胞,了解其早期凋亡情况;镜检观察药物作用后细胞形态的变化.结果:SAHA有抑制癌细胞生长的作用,两药联合具有协同作用或相加作用(P<0.05);SAHA使细胞停滞在G1/G0期,与DDP联合作用后凋亡率增加,使细胞周期进一步阻滞在G1/G0期(P<0.05).镜下可见对照组癌细胞生长旺盛,异型性高,SAHA组与DDP组则可见细胞缩小变形,胞膜皱缩,贴壁不良,肿瘤细胞大量坏死,联用组尤为明显.结论:SAHA联合DDP可以抑制细胞增殖,停滞细胞周期,促进细胞凋亡,二者联合有协同作用.
关键词： 组蛋白去乙酰化酶抑制剂 顺铂 Siha 增敏作用 -
宫颈癌细胞系Siha和C33a中RRM2表达水平与细胞对吉西他滨敏感性的相关分析
目的：研究宫颈癌细胞系C33a和Siha中核糖核苷酸还原酶小亚基M2（RRM2）表达与细胞对吉西他滨（Gem）敏感性的相关性。方法：以0.1～3.2μmol/L Gem处理C33a细胞，以0.5～512μmol/L Gem处理Siha细胞，72 h后用MTT法测定细胞活力，计算半数抑制浓度（IC50）；使用Western blot法和逆转录-聚合酶链反应检测各细胞中RRM2表达；采用浓度梯度倍增和大剂量冲击相结合的方法对Siha细胞进行Gem耐药诱导培养，构建Siha/Gem耐药细胞株；在Siha/Gem细胞中，使用RNA干扰技术敲低RRM2表达并检测敲低前后Gem对细胞的IC50。结果：Gem对C33a、Siha细胞的IC50分别为0.63、16.8μmol/L。与C33a细胞比较， Siha细胞中RRM2的表达较高。与Siha细胞相比，Siha/Gem耐药细胞（耐药指数为16.26）中RRM2表达增强。Gem对敲低RRM2表达的Siha/Gem耐药细胞的IC50降低，其逆转耐药倍数为4.24。结论：宫颈癌细胞系中RRM2表达可能与细胞对Gem的敏感性呈负相关，敲低RRM2表达可增加细胞对Gem的敏感性。
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宫颈癌细胞株survivin mRNA表达的分子信标检测
目的:探讨宫颈癌细胞株中survivin mRNA表达分子信标荧光显像的检测.方法:体外培养宫颈癌细胞株HeLa和SiHa,滴加100nM的survivin mRNA分子信标,荧光显微镜下观察荧光强度,并用western blot及免疫组化方法对其表达进行验证.结果:两种Survivin mRNA MB在HeLa和SiHa中观察到了强荧光信号,且SiHa荧光信号强于Hela.结论:分子信标技术可成功检测宫颈癌细胞survivin mRNA的表达,为宫颈癌的早期诊断提供了又一可能的手段.
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HIF-1α对人宫颈癌SiHa细胞增殖和凋亡的影响
目的 观察缺氧诱导因子1α(HIF-1α)在缺氧条件下对宫颈癌SiHa细胞的增殖、生长和凋亡的影响,探讨HIF-1α在宫颈癌的发展过程中所起的作用.方法 将表达全长HIF-1α的重组质粒pcDNA3.1-full lengthHIF-1α和空质粒pcDNA3.1转染人SiHa细胞中,分别命名为fL HIF-1α组和pcDNA3.1组,未转染细胞组命名为未转染组.应用Western Blotting和免疫细胞化学法对细胞内的HIF-1α和VEGF表达量进行检测.应用MTT方法检测不同浓度的CoCl2处理后细胞的增殖情况;采用原位缺口末端标记(TUNEL)法检测细胞的凋亡情况.结果 免疫细胞化学和Western Blotting结果显示重组质粒pcDNA3.1-full length HIF-1α转染成功,转染细胞内HIF-1α及VEGF表达较未转染细胞和质粒pcDNA3.1转染细胞增高(P<0.05),显示在正常或缺氧条件下.fLHIF-1α组细胞的增殖能力均高于pc DNA3.1组和未转染组(P<0.05),凋亡率小于pcDNA3.1组和未转染组,差异均有统计学意义(P<0.05).结论 HIF-1α在CoCl2诱导的缺氧条件下可以抑制SiHa细胞的凋亡,减少缺氧对细胞的损伤以及促进细胞的增殖,提示HIF-1α在官颈癌的发生发展中可能起着重要作用.
