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C-myc蛋白在宫颈鳞癌中的表达及其与HPV16/18 E6蛋白表达的关系
目的:检测C-myc蛋白在宫颈鳞癌中的表达状态,并探讨C-myc蛋白表达与HPV16/1 8E6蛋白表达之间的关系.方法:采用免疫组化SP法对21例慢性宫颈炎、40例宫颈上皮内瘤变和71例浸润性宫颈鳞癌进行C-myc蛋白和HPv16/1 8E6蛋白的检测.结果:慢性宫颈炎、宫颈上皮内瘤变Ⅰ级、Ⅱ级、Ⅲ级C-myc蛋白阳性率均很高,而浸润性宫颈鳞癌C-myc蛋白阳性率下降(P＜0.05);HPV16/1 8E6阳性组和HPV16/18E6阴性组之间C-myc蛋白阳性率无差异.结论:浸润性宫颈鳞癌C-myc蛋白表达明显下降,并且C-myc蛋白表达与HPv16/18E6蛋白表达之间未见明显相关.
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HPV16/18 E6蛋白及P53蛋白在宫颈癌中的状态
目的:探讨HPV16/18E6蛋白和P53蛋白在宜昌地区宫颈鳞癌组织中的表达及相关关系.方法:用免疫组化SP法对36例宫颈鳞癌及28例慢性宫颈炎中的HPV16/18E6蛋白和P53蛋白进行检测.结果:宫颈鳞癌中E6和P53阳性率均明显高于慢性宫颈炎组,并且E6阳性的宫颈鳞癌与慢性宫颈炎P53阳性率明显高于E6阴性组.结论:HPV16/18感染与宜昌地区宫颈鳞癌的发生密切相关,至于HPV16/18E6蛋白与P53蛋白之间的内在联系尚有待于进一步研究.
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宁波地区妇女宫颈感染HPV58分布与变异谱系分析
目的 了解宁波地区人乳头瘤病毒高危亚型HPV58的型别分布和癌相关基因E6、E7区基因变异谱系特征.方法 收集调查社区和医院就诊妇女的宫颈脱落细胞样本进行HPV分型检测,并对其中HPV58亚型阳性株进行癌相关基因测序和序列分析.结果 778例社区人群样本HPV58阳性16例,检出率2.06％,1 835例就诊人群样本HPV58阳性74例,检出率4.03％;HPV58病毒株E6、E7基因序列分别成功获得6和11条,E6区有2个位点发生碱基颠换:C307T和A388C,E7区有5个位点发生碱基颠换:G694A、T726C、T744G、G761A和T803C;系统进化树分析显示宁波地区HPV58变异株主要位于该亚型基因变异谱系A的A1和A2分支.结论 宁波人群HPV58感染率较高,多数感染者携带病毒的癌相关基因发生变异,应加强对人群HPV感染及其持续感染状况的监测,尤其是HPV58阳性人群.
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CRISPR/Cas系统干扰HPV16 E6基因对SiHa细胞增殖和凋亡影响
目的 研究人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV) 16型的E6病毒癌基因被特异性靶向HPV16-E6位点成簇的、规律间隔的短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)定点敲除后,宫颈癌细胞系SiHa在细胞凋亡和增殖方面的变化.方法 设计靶向HPV16 E6基因的向导RNA(guide RNA,gRNA),脂质体介导gRNA质粒和Cas9质粒对HPV16阳性人宫颈癌细胞系SiHa和HPV16阴性的正常人胚肾上皮HEK293细胞转染.流式细胞术检测SiHa和HEK293细胞转染前后细胞在凋亡率方面的变化;CCK8法检测转染前后两种细胞的增殖能力变化;蛋白质印迹法检测E6基因敲除后,SiHa细胞中E6蛋白和p53蛋白的表达水平.结果 将靶向HPV16 E6基因的gRNA质粒和Cas9质粒共同转染SiHa细胞48 h后,E6-gRNA/Cas9组SiHa细胞凋亡率为25.6％,与未转染gRNA和Cas9质粒的SiHa细胞空白组(2％)以及只转染等量Cas9质粒的Cas9组(3％)相比明显上升,差异有统计学意义,F=58.500,P＜0.001;而只转染等量Cas9质粒的Cas9组和空白组SiHa细胞的凋亡率差异无统计学意义,P＞0.05.CCK8实验表明,转染72 h后,与空白组相比,E6-gRNA/Cas9组SiHa细胞增殖抑制率为31.3％,细胞增殖抑制明显,P=0.008;转染96 h后,与空白组相比,E6-gRNA/Cas9组细胞增殖抑制率为30.6％,P=0.002;而不表达HPV16 E6基因的HEK293细胞的增殖能力未被抑制,3组细胞之间增殖能力相比差异无统计学意义,F=0.219,P=0.810.转染48 h后,与空白组相比,SiHa细胞E6蛋白表达下降,E6蛋白表达抑制率为-45.24％,三组之间E6蛋白表达量差异有统计学意义,F=30.392,P＜0.001;与空白组相比,p53蛋白表达上调+250.08％,3组p53蛋白表达量差异有统计学意义,F=50.530,P＜0.001.结论 应用CRISPR特异性地抑制HPV16 E6基因表达可以诱导SiHa细胞凋亡,抑制SiHa细胞增殖,下调E6蛋白并且上调p53蛋白表达.
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HPV16-E6-DNA对宫颈癌预后预测价值分析
目的 探讨宫颈癌组织中高危型人乳头瘤病毒(high risk human papillomavirus,HR HPV) 16型的致癌基因E6(HPV16-E6-DNA)病毒载量情况及其对肿瘤预后的影响.方法 收集2000-06-04-2006-12-08武汉大学中南医院妇瘤科134例宫颈癌患者,均首次诊断为宫颈癌,行宫颈癌根治性切除术,术后经病理确诊,且随访资料完整.提取石蜡组织DNA,将HPV16-E6亚克隆到pcDNA3.1-myc HisA载体上,利用荧光定量PCR(RT-PCR)技术检测宫颈癌组织中HPV16-E6-DNA病毒载量,并采用Spearman相关分析、Kaplan-Meier和多因素Cox比例风险回归模型分析HPV16-E6-DNA病毒载量与各临床病理特征的相关性,及其对总生存率的影响.结果 HPV16-E6成功克隆到pcDNA3.1 myc-HisA载体上.相关性分析显示,HPV16-E6-DNA病毒载量在宫颈癌组织的表达水平与宫颈癌患者年龄(P＜0.001)、FIGO分期(P＜0.001)和淋巴结转移(P＜0.001)相关.Kaplan-Meier生存分析显示,HPV16-E6-DNA病毒拷贝数＞10 7组5年总生存率为39.4％,105～107组为44.0％,＜10 5组为86.3％,差异有统计学意义,P＜0.001.单因素分析显示,年龄(P＜0.001)、HPV16-E6-DNA病毒载量(P＜0.001)、病理分级(P=0.049)、FIGO分期(P＜0.001)、深肌层浸润(P=0.001)、宫旁阳性(P=0.010)和淋巴结转移(P=0.012)是影响预后的主要因素.Cox回归分析显示,淋巴结转移(P=0.002)和HPV16-E6-DNA病毒载量(P=0.010)是预后的独立危险因素.结论 宫颈癌组织中,HPV16-E6-DNA病毒载量明显增加,其表达是宫颈癌根治性切除术后的总体生存率的独立预后因素,可作为宫颈癌根治性切除术后的预后预测因子之一.
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人乳头瘤病毒58型E6E7融合基因突变体的转化活性及抗原性
目的 探讨人乳头瘤病毒(HPV) 58型E6E7融合基因突变体的转化活性及抗原性.方法 分别定点突变HPV58型E6和E7基因中3个氨基酸的密码子,去除突变后的E6和E7基因的终止码并将其基因片段融合,突变修饰后的基因命名为HPV58 mE6E7.将重组质粒转染NIH/3T3细胞,pIRES-neo-HPV58 mE6E7转染组为实验组,pIRES-neo-HPV58 E6E7转染组为阳性对照组,pIRES-neo空载转染组为阴性对照组.流式细胞术、免疫荧光和Western blot检测转染细胞HPV58 mE6E7融合蛋白的表达,软琼脂集落形成和裸鼠皮下成瘤实验检测HPV58mE6E7融合蛋白的转化活性.以HPV58 mE6E7融合基因为靶抗原构建DNA疫苗,免疫小鼠后采用酶联免疫吸附试验检测免疫鼠血清中特异性抗体,酶联免疫斑点法检测免疫鼠脾淋巴细胞中可分泌γ干扰素的特异性CD8+T细胞数.结果 将pGEM-T easy/HPV58 mE6E7和pMD-18T/HPV58 E6E7质粒分别测序,HPV58 E6E7融合基因与HPV58型E6和E7基因标准序列的同源性达100％,并证实点突变成功.稳定转染HPV58mE6E7和HPV58 E6E7的NIH/3T3细胞表达率分别为70.3％和84.1％.实验组和阳性对照组HPV58mE6E7和HPV58 E6E7融合蛋白的相对表达水平分别为2.1±1.7和3.8±1.4,阴性对照组HPV58 mE6E7和HPV58E6E7融合蛋白呈阴性表达.实验组和阴性对照组未见集落形成；阳性对照组有31个集落形成,其中＞ 50个细胞的集落10个.实验组和阴性对照组细胞接种裸鼠后,在4周内均未成瘤；而阳性对照组中有6只裸鼠形成肿瘤.以HPV58 mE6E7融合基因为靶抗原的DNA疫苗具有良好的抗原性,抗体滴度为25 600,特异性免疫斑点数为(218.8 ±34.4)个,明显高于对照组.结论 修饰后的HPV58E6E7基因可融合表达,并在消除其转化活性的同时保留其抗原性,可作为HPV58阳性相关肿瘤治疗性DNA疫苗的靶基因.
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宫颈癌标本中HPV16的E6、E7和LCR的变异研究
目的:探究分析E6、E7和LCR(long control region,LCR)在宫颈癌标本中HPV16中的变异情况.方法:随机选取我院病理实验室于2015年1月至2016年1月期间留存的HPV16阳性宫颈癌标本100例为研究对象,分别采用PCR技术进行E6、E7和LCR片段的扩增处理,并采用DNA序列进行PCR扩增产物的序列测定,分析E6、E7和LCR的变异表现.结果:E6基因中常见变异为T350G(67.27％),E7基因中常见变异为T789C(72.67％),LCR常见变异为G7521A (90.90％),LCR区中出现G7799A、A7636C、C13T、C7678T新变异,E7区高度保守,YY1转录因子结合点是LCR变异的主要集中点.结论:宫颈癌标本中HPV16存在E6、E7和LCR变异情况,分析高危型HPV变异有助于宫颈癌HPV的早期诊断,可将其应用于宫颈癌防治的疫苗设计中,具有广泛的临床应用前景.
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RNA干扰HPV E6下调eIF4E转录表达抑制宫颈癌He1a细胞增殖并影响细胞周期进程研究
目的 探讨宫颈癌Hella细胞中干扰HPV E6对eIF4E表达的调控,探寻HPV E6促癌的新途径,为宫颈癌诊断和治疗提供新靶点.方法 构建高效的靶向HPV18 E6的shRNA质粒(shE6)并测序,而后转染人宫颈癌Hela细胞,荧光显微镜及流式细胞术检测转染效率.而后以Real-time PCR检测E6及eIF4E的mRNA水平,采用CCK-8法检测Hela细胞增殖能力的改变,流式细胞术检测细胞周期.结果 测序结果显示成功构建shE6质粒.shE6-3转染人宫颈癌Hela细胞后48 h,E6及eIF4E mRNA表达的抑制率分别约为80％,76％.shE6-3对Hela细胞的增殖活性在48 h的抑制效果明显,增殖抑制率约为21％;相对于NC组,shE6组Go/G1期细胞比例显著增高,而S期比例减少,G2/M期未见明显变化.结论 RNA干扰HPV E6能够下调eIF4E转录表达,抑制宫颈癌Hela细胞增殖,并阻滞细胞周期于G0/G1期.eIF4E有望成为宫颈癌防治的潜在靶点.
关键词： 宫颈癌 E6 真核细胞翻译起始因子 RNA干扰 -
HPV E6/E7研究现状及临床展望
人乳头状瘤病毒是宫颈癌重要的致病因素,其早期蛋白E6/E7的持续表达可致细胞p53、pRb蛋白缺失或失活,并通过多种机制与其他细胞因子相互作用,促使细胞发生癌变.其mRNA表达水平提示病毒转录活性,可能具有诊断和预测宫颈病变的价值,因此有研究应用HPV E6/E7 mRNA筛查不同人群宫颈病变并随访、预测病变发生风险,但各研究结果不一,不同mRNA检测方法也是影响研究结果的因素之一.HPV E6/E7蛋白检测在临床应用较少,而以HPV E6/E7为靶点的宫颈癌免疫治疗已成为研究的热点,在动物实验及临床前研究中取得了一定进展.
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HPV16 E6 E7 siRNA作用于人宫颈癌细胞株的实验研究
目的:使用HPV16 E6、E7 siRNA处理表达HPV16阳性的人宫颈鳞癌细胞株CaSki和SiHa,观察其对HPV16 E6、E7原癌基因的特异性抑制作用,为探讨使用siRNA治疗宫颈癌的可行性提供实验基础.方法:分别设计并合成靶向于HPV16 E6、E7的siRNA各3条,经脂质体包裹后转染两株细胞,分别采用RT-PCR和Western Blot方法,通过对转染前后各时间段两基因mRNA及蛋白的表达情况的检测,验证RNAi作用的特异性及时效性.结果:同对照组相比,各E6、E7 siRNA均可引起靶基因表达水平的显著性下降(P＜0.05);而空脂质体组及阴性对照siRNA组的靶基因表达水平则无明显变化.其中E6-1 siRNA和E7-2 siRNA对靶基因抑制作用较强.E6-1 siRNA和E7-2 siRNA转染两株细胞后24h、48h、72h及96h均可观察到靶基因表达的显著性降低(P＜0.05),而对相应的非靶基因无明显抑制作用.结论:不同序列的E6、E7 siRNA,对靶基因的干扰效率不同;E6、E7 siRNA分别作用于宫颈鳞癌细胞株,均引起了靶基因的特异、高效性的抑制,而时非靶基因的表达无明显变化,且抑制作用至少维持到转染后96h.为进一步研究采用RAN干扰技术进行宫颈癌的生物治疗奠定了基础.
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高危型人乳头瘤病毒E6、E7 mRNA检测筛检宫颈癌的临床评价
目的:探究高危型人乳头瘤病毒(HPV)E6、E7mRNA检测筛检宫颈癌的临床应用价值.方法:选取2016年3月—2017年3月因宫颈疾病于我院就诊的83例患者为观察对象,采集其宫颈样本后,对宫颈液基薄层细胞学检查(TCT)常规筛检异常的患者阴道镜下取活检组织送病理学检查,以病理学检查结果为金标准,比较高危型HPV E6、E7 mRNA与HPV-DNA分型检出率、敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值及检测费用、患者满意度.结果:高危型HPV E6、E7mRNA检出率57.83％与HPV-DNA分型检出率62.65％比较,差异无统计学意义(P>0.05),且慢性宫颈炎、CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ、宫颈癌的检出率比较,差异无统计学意义(P>0.05);高危型HPV E6、E7mRNA与HPV-DNA分型检测敏感性、阳性预测值、阴性预测值比较,差异无统计学意义(P>0.05);高危型HPV E6、E7mRNA检测特异性显著高于HPV-DNA分型(P<0.05);与HPV-DNA分型检测比较,高危型HPV E6、E7mRNA检测费用显著较低,患者满意度显著较高,差异具统计学意义(P<0.05).结论:高危型HPV E6、E7mRNA筛检宫颈癌特异性更高,能减少因误诊造成的过度检测及治疗,提高患者满意度,减轻其经济负担.
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HPV E6/E7 mRNA检测在HPV分型及宫颈疾病筛查中的作用研究
目的 探讨人乳头瘤病毒 (HPV) E6/E7 m RNA检测在女性宫颈疾病筛查中的作用.方法 选取2016年9月至2017年9月贵州医科大学附属医院妇产科门诊和住院部就诊的HPV阳性感染者287例, 其中宫颈疾病患者267例[包括宫颈炎、宫颈上皮内瘤变 (CIN) ⅠⅢ、宫颈癌], 阳性感染者中体检无疾病表现及病理学检查无宫颈病变者20例.取患者宫颈脱落细胞用支链DNA技术 (简称b-DNA技术) 检测高危HPV E6/E7 m RNA, 患者同时行宫颈液基薄层细胞检测和HPV分型检测, 对不同年龄、HPV分型、阴道细胞学分型 (简称TBS分型) 及疾病分级的HPV E6/E7 m RNA的诊断价值进行效能分析.结果 在不同年龄段内E6/E7阳性和阴性所占比例差异有统计学意义, P＜0.05, 在年龄组≤30岁组和＞5060岁组, E6/E7阳性者所占比例大, 分别为85.40％和84.40％;而HPV E6/E7m RNA拷贝数在不同年龄组内差异没有统计学意义.E6/E7结果在单一感染和混合感染, 以及单一感染和多重感染间差异无统计学意义;在不同感染型别中, 只有HPV 16型随病变严重程度的增加其感染率呈递增趋势 (P＜0.05), 其余HPV型与病变严重程度无明显相关性 (P＞0.05).不同疾病分组间, E6/E7阳性率的分布差异有统计学意义, 表现为无宫颈病变组 (0) ＜宫颈炎 (15.60％) ＜CINⅠ (86.20％) ＜CINⅡ (93.00％) ＜ CINⅢ (96.50％) ＜宫颈癌 (100.00％), P＜0.05;E6/E7拷贝数表达差异有统计学意义, 表现为宫颈炎1773.89 (936.54) ＜CINⅠ4997.74 (10 439.75) ＜CINⅡ52 655.02 (38 495.10) ＜CINⅢ72 300.12 (38 298.57) ＜宫颈癌121 616.68 (34 348.59), P＜0.05.结论 在宫颈疾病中检测高危型HPVE6/E7 m RNA的转录对女性宫颈癌高危人群的筛查和诊治具有重要的价值, 或可作为进一步分流HPV阳性病人的方法.
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妇女子宫颈感染人乳头瘤病毒高危亚型HPV52的遗传变异性分析
目的 了解宁波地区人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)高危亚型HPV52的分布和癌相关基因E6、E7区基因变异情况.方法 收集宁波市社区妇女的宫颈脱落细胞样本进行HPV分型检测,并对其中HPV52亚型阳性株进行癌相关基因测序和序列分析.结果 从778份样本中检出HPV52阳性24例,检出率为3.1％.获得E6、E7基因序列分别为21和19条.E6区有3个位点发生碱基颠换:G350T、G356A和A379G,其中G350T和A379G出现率高,占95.2％;E7区有3个位点发生碱基颠换:C751T、A801G和A849C,其中C751T和A801G出现率高,占94.7％.系统进化树分析显示,宁波地区HPV52型存在亚洲型和欧洲型.结论 宁波社区人群HPV52感染率较高,多数感染者携带病毒的癌相关基因发生变异,应加强对人群HPV感染状况和病毒株变异情况的监测,及时调整宫颈癌防治策略.
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HPV E6,p53与宫颈癌的关系及其在基因治疗中的应用
目前宫颈癌的发病率仍居全世界妇女常见恶性肿瘤的第二位.高危型人乳头瘤病毒(high-risk Human Papillomavirus,HR-HPV)感染是宫颈癌及其癌前病变主要的诱因之一.抑癌基因p53能够有效地抑制细胞增殖和促进细胞凋亡,人类近半数的肿瘤都与p53基因的突变和失活有关,HPV E6蛋白降解p53蛋白,是宫颈癌发生的前提.选择性杀伤p53功能缺失的肿瘤细胞,同时保护正常细胞,发展HPV疫苗及联合用药是临床肿瘤免疫学家进行宫颈癌基因治疗的目标.
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靶向HPV16-E 6的siRNA对宫颈癌细胞的影响
目的:构建并筛选出HPV16-E6基因特异的有效的小干扰RNA表达载体,观察其对宫颈癌细胞中HPV16-E6基因表达的长期影响,探讨E6基因在宫颈癌发生过程中的分子作用机制,为临床HPV感染及官颈癌治疗探索新方法.方法:应用Fugene 6为转染试剂,将HPV16-E6 siRNA转染入CaSki细胞,Western blot方法检测HPV16-E6的表达;MTT分析检测HPV16-E6 siRNA对细胞增殖活性的影响;流式细胞术检测HPV16-E6 siRNA对细胞周期和细胞凋亡的影响.结果:siRNA抑制宫颈癌CaSki细胞中HPV16-E6的表达;siRNA抑制宫颈癌CaSki细胞增殖;siRNA抑制宫颈癌CaSki细胞的细胞周期行进,诱导CaSki细胞凋亡;结论:在CaSki细胞中,靶向HPV16-E6的siRNA能够有效抑制细胞增殖,诱导细胞周期阻滞于C0/G1期,并诱导细胞凋亡.
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宫颈腺癌p53、HPV16/18-E6蛋白和ER的表达及其临床意义
目的探讨宫颈腺癌组织中p53蛋白、HPV16/18-E6蛋白及ER的表达及其临床意义.方法采用免疫组织化学S-P法对63例宫颈腺癌组织进行p53蛋白、HPV16/18-E6蛋白及ER检测.结果63例宫颈腺癌中p53、HPV16/18-E6蛋白和ER阳性表达率分别为为52.3%、31.7%和49.2%.p53表达与肿瘤病理分级、临床分期(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期)有关.HPV16/18-E6、ER的表达与宫颈腺癌的病理学分级、临床分期无关,但与p53表达呈负相关(P＜0.01),HPV16/18-E6、ER在宫颈腺癌中的表达呈正相关(P＜0.01).结论随宫颈腺癌组织病理分级和临床分期增高p53阳性表达率逐渐增高,可能与p53突变有关,部分宫颈腺癌的发病可能与HPV16/18-E6蛋白过度表达有关.部分宫颈腺癌可能属于激素依赖性,雌激素可能有协同HPV致癌的作用.
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p53和HPV-16、18 E6蛋白在宫颈癌的表达
目的探讨宫颈癌中抑癌基因p53蛋白与HPV-16、18癌基因E6蛋白的表达及其意义.方法采用SP免疫组织化学方法,检测68例宫颈癌和8例慢性宫颈炎上皮组织中p53和HPV-16、18 E6蛋白的表达.结果 68例宫颈癌中有17例p53蛋白和60例HPV-16、18 E6蛋白呈阳性表达,阳性率分别为25.0%和88.2%.p53蛋白阳性表达与组织学类型有关,其阳性率在宫颈腺癌中为83.3%和宫颈鳞癌中为17.2%,有极显著性差异(P＜0.01);p53蛋白表达也与临床分期相关,该蛋白阳性表达率随着临床分期上升而增高.p53表达同肿瘤分化程度,淋巴结转移无关(P＞0.05).HPV-16、18 E6蛋白在宫颈癌组织中的表达同肿瘤分化程度、淋巴结转移、组织学类型和临床分期无关(P＞0.05).在慢性宫颈炎上皮组织中均无p53和HPV-16、18 E6蛋白表达.结论 p53蛋白阴性和弱阳性表达以及HPV-16、18 E6蛋白过度表达与宫颈癌发生有关,但在宫颈腺癌和临床分期升高的宫颈癌组织中,p53蛋白阳性表达的增强可能是p53基因突变的结果,或者与其他细胞蛋白结合,阻止了HPV-16、18 E6蛋白对p53蛋白的降解作用,使p53蛋白稳定性增加和阳性表达水平提高.
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人乳头瘤病毒E6蛋白通过上调氯离子蛋白通道5的表达促进宫颈癌细胞迁移
目的:探讨人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV) E6蛋白与氯离子通道蛋白5(chloride voltage-gated channel 5,CLCN5)之间的关系以及CLCN5对宫颈癌细胞迁移的影响.方法:采用RNA干扰技术敲低HPV E6基因,实时荧光定量PCR(RT-qPCR)和蛋白质印迹法检测敲低HPV E6后宫颈癌HeLa细胞中CLCN5 mRNA及蛋白的表达水平.通过PCR扩增CLCN5基因片段,并将其克隆至表达载体pCDNA3.1-3×Flag(简称pCDNA3.1)质粒中,构建重组质粒pCDNA3.1-CLCN5.将目的质粒pCDNA3.1-CLCN5及其对照pCDNA3.1质粒分别转染宫颈癌HeLa细胞,蛋白质印迹法检测CLCN5蛋白的表达.Transwell迁移实验检测过表达CLCN5对宫颈癌HeLa细胞迁移的影响.同时,将CLCN5的小干扰RNA及其阴性对照分别转染宫颈癌HeLa细胞,Transwell迁移实验检测敲低CLCN5对宫颈癌HeLa细胞迁移的影响.结果:RT-qPCR和蛋白质印迹检测结果显示,敲低HPV E6可显著降低CLCN5的mRNA和蛋白表达水平.质粒双酶切鉴定以及核酸测序比对结果证实重组质粒pCDNA3.1-CLCN5构建成功.蛋白质印迹检测结果显示CLCN5蛋白在宫颈癌HeLa细胞中被有效过表达或敲低.Transwell迁移实验结果表明,过表达CLCN5可促进宫颈癌细胞的迁移,敲低CLCN5可抑制宫颈癌细胞的迁移.结论:HPV E6蛋白通过上调CLCN5的表达促进宫颈癌细胞迁移.
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钙调素拮抗剂E6对大鼠脑一氧化氮合酶活性和突触体谷氨酸释放的影响
目的探讨钙调素拮抗剂E6的抗脑缺血作用机制.方法用[3H]-L-Glu(glutamic acid,Glu)标记大鼠脑突触体,测定突触体的Glu释放量和用一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)试剂盒测定成年大鼠脑匀浆上清中NOS活性.结果 E6促进Glu释放(与对照组比,10-5mol@L-1组增加81.0%),但对KCl(50 mmol@L-1)引起的Glu释放有抑制作用,10-5mol@L-1E6的抑制率为23.2%.E6浓度依赖性地抑制NOS活性.钙调素(calmodulin,CaM)(30μg@ml-1)可逆转E66的抑制作用(10-6mol@L-1E6的抑制率为13.7%),N-硝基-精氨酸((N-nitro-arginine,L-NNA)(10 μmol@L-1)可加强E6的抑制作用(10-6mol@L-1的抑制率为76.5%).结论 E6是与CaM结合后发挥抑制NOS活性效应的,E6对Glu释放的影响可能与其对NOS活性及其对神经细胞内Ca2+影响有关.
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宁波市奉化区女性宫颈人乳头瘤病毒18型感染流行变异谱系分析
目的 了解宁波市奉化地区妇女感染HPV高危亚型18相关基因E6、E7区基因变异谱系特征.方法 采用整群随机抽样方法,收集宁波市奉化区778例妇女的宫颈脱落细胞样本进行HPV分型检测,并对其中HPV18阳性株进行癌相关基因E6、E7区测序和序列分析.结果 HPV18检出率为1.3％(10/778),HPV18病毒株E6、E7基因序列分别成功获得11和10条,E6区有1个位点发生碱基颠换(C287G),E7区未发现突变;系统进化树分析显示,奉化地区HPV18变异株主要位于该亚型基因变异谱系A的A1亚系.结论 宁波市奉化地区妇女HPV18感染率较低,HPV18病毒株癌相关基因变异较小.
