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QD800对舌鳞癌细胞生物学行为的影响
目的：研究近红外量子点（QD800）对人舌鳞癌细胞（Tca8113细胞）的生长、成瘤、增殖及凋亡的影响。方法（1）QD800对Tca8113细胞标记后6 h、12 h、24 h、3 d、5 d、7 d用流式细胞仪检测细胞的标记率及平均荧光强度。（2）用浓度为10 nmol/L的QD800标记的Tca8113细胞及未标记的Tca8113细胞行裸鼠皮下成瘤，观察QD800对Tca8113细胞成瘤能力的影响。（3）用流式细胞仪检测QD800对Tca8113细胞增殖及凋亡的影响。结果（1）QD800对Tca8113细胞标记后6 h、12 h、24 h、3 d、5 d、7 d用流式细胞仪检测细胞的标记率分别为92.30%、77.07%、67.36%、49.59%、15.25%、8.37%，平均荧光强度分别为211.23、187.63、113.08、100.47、85.86、47.28。（2）Tca8113/QD800组和Tca8113组在皮下接种24 d后肿瘤的平均重量分别为（1.22±0.12）g、（1.25±0.16）g。（3）Tca8113/QD800和Tca8113体内成瘤24 d后细胞的平均增殖指数为（48.21±1.13）%、（47.25±1.27）%，平均凋亡指数为（11.33±0.65）%、（10.66±0.57）%。结论用近红外量子点QD800标记Tca8113细胞后不影响其生长、成瘤、增殖及凋亡能力。
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小鼠乳腺癌细胞4T1对不同品系小鼠乳腺癌模型的影响
目的:将小鼠乳腺癌细胞4T1接种到两种不同品系的小鼠脂肪垫,观察植瘤小鼠的生物学状态、成瘤大小、转移情况以及生存周期等指标,为建立不同品系小鼠的乳腺癌模型提供参考.方法:将小鼠乳腺癌细胞4T1胰酶消化去除上清,用PBS洗两遍,后用生理盐水调整细胞数量为1×106个,分别接种到裸鼠和BABL/c小鼠的脂肪垫.比较各组老鼠的成瘤率、成瘤时间以及生存期等实验指标.结果:原位注射1×106个4T1细胞时两组均能成瘤,但是裸鼠的成瘤率高于BABUc小鼠;裸鼠的成瘤大小明显大于BABL/c小鼠;裸鼠的生存期明显短于BABL/c小鼠;裸鼠出现肺转移结节明显多于BABL/c小鼠.结论:不同免疫能力的小鼠对接种相同数量的细胞数可能会产生不同的实验结果,在选择构建小鼠乳腺癌模型的时候一定要综合考虑所选用品系的小鼠是否会对实验结果带来影响.
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IL-18基因转染对小鼠卵巢癌OVHM细胞体内成瘤的影响
目的 分析转染IL-18基因后,对小鼠卵巢癌OVHM细胞体内成瘤的影响,初步探讨IL-18基因转染治疗卵巢癌的应用价值.方法 将逆转录病毒携带的小鼠IL-18基因成功转染至OVHM(OVHM/IL-18),以空载体转染的OVHM(OVHM/LXSN)和野生型(OVHM)作为对照,于裸鼠皮下分别接种细胞,观察各组种植瘤生长情况,计算成瘤率;HE染色及电镜分别观察病理组织切片的形态学改变.结果 三组裸鼠的成瘤率相同,但OVHM/IL-18组成瘤时间较晚,随瘤龄增长肿瘤生长缓慢;瘤组织较小、界限清楚,血供不丰富,瘤细胞数量少、恶性程度较低,可见中性粒细胞、淋巴细胞浸润及细胞凋亡、组织坏死现象.OVHM组和OVHM/LXSN组的瘤组织较大、与周围组织界限不清,血管丰富,瘤细胞密集、恶性程度较高.结论 IL-18基因成功转染后,可能通过促进肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤血管形成及促进免疫浸润等机制,达到抑制肿瘤生长、降低卵巢癌恶性程度的抗瘤作用.
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Foxp3对肺癌细胞增殖及成瘤的影响
目的：：研究转录因子Foxp3在肺癌细胞中的高表达对肺癌细胞增殖及成瘤的影响。方法：利用脂质体转染法建立稳定高表达 Foxp3的 NCIH-hFoxp3肺癌细胞株。 MTT法观测 NCIH-hFoxp3及对照细胞的增殖。 ELISA 法检测 NCIH-hFoxp3及对照细胞IL-8、IL-10的分泌。建立移植瘤小鼠模型,观察成瘤情况。结果：成功建立高表达Foxp3的NCIH-hFoxp3肺癌细胞株；与阴性对照相比,NCIH-hFoxp3细胞增殖减慢,但成瘤能力强。 NCIH-hFoxp3细胞培养上清IL-8表达量减低,IL-10表达量升高。结论：高表达Foxp3的肺癌细胞可能通过表达细胞因子改变局部生长的微环境,逃逸免疫监视,而促进肿瘤细胞的成瘤和发展。
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低氧环境下甲酰肽受体1拮抗剂Boc2对人肺腺癌细胞恶性生物学行为的影响
目的:探讨低氧环境下甲酰肽受体1(formyl peptide receptor1,FPR1)的拮抗剂Boc2对人肺腺癌细胞迁移、侵袭、增殖及成瘤能力的影响.方法:采用Western blotting检测低氧诱导下人肺腺癌细胞A549中低氧诱导因子1α(hypoxia inducible factor 1α,HIF-1α)和FPR1蛋白的表达情况.以FPR1拮抗剂Boc2体外处理低氧诱导的A549细胞,按照随机数字表法分为3组:对照组(常氧条件下培养)、低氧组和低氧+Boc2处理组.细胞划痕实验、Transwell细胞侵袭实验及MTT法分别用于检测各组细胞的迁移、侵袭和增殖能力.接种A549细胞制备裸鼠移植瘤模型,同上分3组,4周后处死裸鼠,分析各组间裸鼠移植瘤体积、质量、成瘤率以及迁移相关蛋白E-钙黏素(E-cadherin,E-cad)和侵袭相关蛋白MMP-9表达量的差异性.结果:低氧诱导能促进A549细胞FPR1蛋白的表达,且呈时间依赖性(P＜0.05).与对照组相比,低氧组细胞的迁移、侵袭及增殖能力均显著增强(P＜0.01),而相对低氧组,Boc2处理能显著抑制A549细胞的迁移、侵袭和增殖能力(P＜0.05).低氧组裸鼠成瘤率为100.0％(15/15),对照组为60.0％(9/15),低氧+Boc2处理组裸鼠成瘤率为73.3％(11/15);低氧组裸鼠移植瘤体积、质量均显著高于对照组(均P＜0.01);而相对低氧组,低氧+Boc2处理组裸鼠肿瘤体积、质量均有显著降低(均P＜0.01).低氧组E-cad及MMP-9蛋白表达量显著高于对照组(P＜0.01),而与低氧组相比Boc2处理能显著降低E-cad及MMP-9蛋白表达量(P＜0.05).结论:FPR1拮抗剂Boc2能显著抑制低氧诱导的人肺腺癌细胞A549的迁移、侵袭、增殖及成瘤能力,表明FPR1在人肺腺癌的发生发展过程中扮演着重要角色,并有可能成为人肺腺癌治疗的潜在靶点.
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利用集落形成实验和成瘤实验初步研究新基因的成瘤作用
目的探讨新基因尤其是肝癌相关新基因的功能。方法利用集落形成实验和成瘤实验初步分析HC90和HC3898基因的功能。结果①HC90基因的转染能增加SMMC-7721肝癌细胞形成的集落数量；②注射转染了HC90基因的SMMC-7721细胞形成的肿瘤平均瘤重大于注射SMMC-7721细胞的自身对照组；③HC3898全长cDNA转染SMMC-7721细胞能显著抑制集落的形成；④注射转染HC3898基因的SMMC-7721细胞组平均瘤重小于注射SMMC-7721细胞的自身对照组的瘤重，抑瘤率为50%；⑤HC3898实验组瘤块切片检查可见凋亡细胞及凋亡小体，瘤块的组织DNA经1.5%琼脂糖电泳分析，可发现典型的凋亡"阶梯状DNA条带"。结论HC90可能是与肝癌恶性表型相关的新基因，转染SMMC-7721肝癌细胞后能促进肝癌细胞的生长。HC3898基因可能诱导凋亡并抑制肝癌细胞的生长。集落形成实验和成瘤实验是对基因功能进行初步分析的有效方法，可为进一步研究提供线索。
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晚期糖基化终末产物受体对宫颈癌细胞生物学行为的影响
目的 探讨晚期糖基化终末产物受体(RAGE)对宫颈癌SiHa细胞增殖、凋亡等生物学行为及裸鼠成瘤能力的影响及相关机制.方法 SiHa细胞分3组培养,空白对照组为仅添加凝聚胺,空载体组为添加凝聚胺+转染空载体质粒,过表达组为添加凝聚胺+转染RAGE过表达质粒.采用pLenti-C-mGFP-RAGE质粒转染方法构建RAGE基因稳定过表达的宫颈鳞癌SiHa细胞.采用Western blot法检测SiHa细胞RAGE、增殖细胞核抗原(PCNA)、B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、与Bcl-2相互作用的细胞死亡调节因子(Bim)蛋白表达水平,CCK-8法检测RAGE基因对SiHa细胞增殖的影响,流式细胞仪检测RAGE基因对SiHa细胞凋亡的影响.采用裸鼠皮下成瘤法,动态观察RAGE基因对宫颈癌肿瘤生长的影响.结果 转染pLenti-C-mGFP-RAGE质粒可明显上调SiHa细胞中RAGE蛋白的表达.过表达组SiHa细胞的增殖力均明显高于空白对照组及空载体组(均P＜0.05),而过表达组SiHa细胞的凋亡率均明显低于空白对照组及空载体组(均P＜0.05).过表达组PCNA及Bcl-2蛋白表达水平均明显高于空白对照组及空载体组(均P＜0.05),而Bax/Bcl-2表达水平均明显低于空白对照组及空载体组(均P＜0.05),3组Bax及Bim蛋白表达水平比较差异均无统计学意义(均P＞0.05).过表达组裸鼠皮下瘤体体积和瘤体质量均显著高于空载体组的体积和瘤体质量,差异均有统计学意义(均P＜0.05).结论 上调RAGE基因的表达可促进SiHa细胞增殖,抑制SiHa细胞凋亡,促进宫颈癌瘤体的生长,该作用和抗凋亡蛋白Bcl-2相关.
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裸鼠腋下皮肤切开缝合和穿刺套针注射接种人鼻咽癌细胞成瘤效果比较
目的：比较裸鼠腋下皮肤切开缝合和穿刺套针注射接种人鼻咽癌细胞成瘤效果。方法制备鼻咽癌HONE-1细胞裸鼠皮下移植瘤块样本。将8只BALB／c裸鼠随机分为A、B组，各4只。 A、B组分别使用皮肤切开缝合接种和穿刺套针接种方法于裸鼠右侧腋下接种细胞株移植瘤组织块，比较两组裸鼠肿瘤出现时间、体积、质量。结果 A、B组肿瘤出现时间均为接种后第3天。与B组相比，A组裸鼠较早出现精神萎靡、皮肤粗糙、毛发光泽不良、食欲不振、活动量减低、脊椎明显、弓背等状况。两组裸鼠体质量均有所下降，A组比B组肿瘤生长迅速，但差异无统计学意义。 A、B组肿瘤质量分别为（0．85±0．39）、（0．75±0．30） g，两组比较，P＞0．05。结论裸鼠腋下皮肤切开缝合和穿刺套针注射接种人鼻咽癌细胞均能达到好的成瘤效果。
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腹水来源胃癌原代细胞的建立及鉴定
目的：以胃癌患者腹水来源的胃癌细胞为研究对象，旨在探索出一种相对成熟的肿瘤细胞原代培养技术及鉴定方法。方法：对腹水来源胃癌细胞进行原代培养，通过低浓度胰蛋白酶消化法及差速贴壁法进行原代细胞纯化，获得能够稳定传代的胃癌转移瘤细胞系，并通过观察细胞形态、免疫荧光检测、绘制细胞增殖曲线、构建裸鼠皮下移植瘤模型等方法对其进行鉴定。结果：获得1例能够稳定传代的腹水来源胃腺癌细胞株（命名为 CFJ），细胞形态一致，表达上皮性生物标志物，细胞核呈现明显的异型性，能在裸鼠皮下成功构建移植瘤模型，增殖和转移能力强，可见裸鼠纵隔、腋窝等多处淋巴结转移。结论：胃癌转移性腹水可以成为建立原代肿瘤细胞的很好来源。
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膜联蛋白A1在食管癌组织的表达及其临床意义
目的 探讨膜联蛋白A1(Annexin A1)在食管癌发生和发展过程中的生物学作用.方法 采用免疫组织化学分析94例食管鳞状细胞癌组织和周围正常组织中Annexin A1蛋白的表达.采用Annexin A1过表达和敲低慢病毒感染人永生化食管上皮细胞株SHEE,得到稳定细胞株.采用细胞计数试剂盒(CCK-8)分析Annexin A1过表达和敲低细胞株细胞增殖能力;采用Transwell法分析Annexin A1过表达和敲低细胞株细胞侵袭能力;采用软琼脂法分析细胞克隆形成能力;采用体内细胞移植实验分析Annexin A1过表达细胞株在体内形成肿瘤能力.结果 与正常食管组织比较,食管癌组织中Annexin A1蛋白表达水平明显增加(P=0.004).与对照细胞株比较,Annexin A1过表达细胞株细胞增殖能力(P=0.026)和侵袭(P=0.017)能力明显增加,而Annexin A1敲低的细胞株,细胞增殖能力(P=0.019)和侵袭能力(P=0.023)明显下降.与对照细胞株比较,Annexin A1过表达细胞株克隆形成能力明显增强(P=0.022),而Annexin A1敲低细胞株克隆形成能力明显下降(P=0.035).体内成瘤实验显示,与对照细胞株比较,Annexin A1过表达细胞株体内肿瘤形成率明显增加(P=0.001).结论 Annexin A1蛋白在食管癌组织中呈过表达,其参与了食管癌细胞的生长、侵袭和肿瘤形成.
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线粒体融合素-2对裸鼠成瘤性及增殖、转移的影响
目的 观察线粒体融合素(mfn)-2对裸鼠成瘸性及增殖瘤的增殖、转移的影响.方法 裸鼠共分为3组:实验组、空载体对照组、空白对照组,分别将3组MCF-7细胞异种移植到无胸腺小鼠体内.建立裸鼠人乳腺癌移植瘤模型,比较3组裸鼠之间肿瘤的大小和重量,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测3组肿瘤组织mfn2的表达,免疫组织化学半定量检测核增殖抗原(Ki-67)、血管内皮生长因子(VEGF)的表达.结果 实验组、空载体对照组、空白对照组3组肿瘤瘤体质量(单位:g)分别为1.78±0.13、2.84±0.16、2.77±0.12,实验组裸鼠肿瘤重量明显低于对照组(P<0.05),实验组瘤体的体积与两对照组比较差异有统计学意义(P<0.05),实验组mfn2基因高表达(P<0.05),两对照组低表达,两对照组之间差异无统计学意义(P>0.05),实验组与两对照组比较,实验组Ki-67的表达升高,而VEGF的表达明显降低(P<0.05).结论 mfn2基因可明显抑制人乳腺癌成瘤,对人乳腺癌裸鼠移植成瘤后的增殖和转移能力有影响.
关键词： 线粒体融合素基因-2 成瘤 基因治疗 -
不同细胞系在骨肉瘤动物模型中的成瘤差异性比较
目的:探讨不同细胞系在骨肉瘤动物模型中的成瘤差异性.方法:(1)对Mg-63和U-2OS两系细胞分别行细胞划痕实验和transwell实验;(2)32只裸鼠随机分为Mg-63细胞悬液法、组织块法与U-2OS细胞悬液法、组织块法4组,每组8只.两种细胞系分别采取细胞悬液法和组织块移植法进行股骨远端原位骨肉瘤重建,统计4组原位骨肉瘤模型成瘤率、瘤重以及肿瘤转移率等指标.结果:细胞划痕实验中,Mg-63和U-2OS在划痕48 h后迁移距离分别为(381.2±23.6)、(591.9±35.1) μrn.骨肉瘤细胞transwell实验中,Mg-63和U-2OS 16 h后穿膜细胞数分别为24.0±2.6,81.9±3.1.骨肉瘤造模实验中,Mg-63悬液法组成瘤率、肺转移率、淋巴结转移率、4周瘤重分别为62.5％,10.4％,0,(2.1±0.1)g;Mg-63组织块法组分别为100％,76.8％,20.7％,(2.4±0.3) g;U-2OS悬液法组分别为100％,45.8％,0,(2.4±0.6) g;U-2OS组织块法组分别为100％,82.3％,41.1％,(2.6±0.4)g.结论:U-2OS细胞系拥有较高的组织侵袭性和细胞增殖能力,是一种良好的骨肉瘤原位模型制作细胞系.
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S100A4:潜在抑制膀胱癌干细胞的靶分子
目的 应用siRNA技术沉默S100A4基因表达对膀胱癌干细胞增殖及成瘤能力的影响.方法 筛选鉴定出MB49膀胱癌干细胞后,应用核素标记相对和绝对定量(iTRAQ)技术,发现MB49膀胱癌细胞与膀胱癌干细胞表达差异的蛋白质S100A4蛋白.设计并合成S100A4基因特异性的siRNA序列,转染膀胱癌干细胞,应用Western blot和qPCR检测在siRNA对S100A4的影响,体内、外实验观察siRNA抑制S100A4后对膀胱癌干细胞增殖及成瘤能力的影响.结果 通过iTRAQ核素标记结合液相色谱和串联质谱分析,共鉴定出差异蛋白共65个,S100A4在基因表达水平差异显著(差异为5.70,P<0.05).与空白对照组、阴性对照组相比,S100A4 siRNA转染组的S100A4基因和蛋白表达降低(P<0.05).CCK8实验和裸鼠成瘤实验发现,与空白对照组与阴性对照组相比较,siRNA干扰S100A4表达后,膀胱癌干细胞生长明显受到抑制,成瘤能力受到抑制(P<0.05).结论 膀胱癌干细胞中S100A4表达与膀胱癌的复发、转移有关,S100A4蛋白可能成为消灭膀胱癌干细胞,治疗膀胱癌的分子靶标.
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人肝癌细胞HepG2接种于BALB/C裸小鼠移植瘤的性别差异
目的 研究性别对人肝癌细胞HepG2接种于BALB/C裸小鼠成瘤及移植瘤生长趋势的影响.方法 18只4~6周龄BALB/C裸小鼠雌雄各半,按照性别分成雌雄两组,每组9只,将全部裸小鼠肩胛部接种处于对数生长期且浓度为1.0×107/mL的HepG2细胞0.2 mL,10 d后观察两组的成瘤情况并测量肿瘤体积.结果 雌性组成瘤模型4只,成瘤率为44.44%;雄性组成瘤模型9只,成瘤率为100.00%,差异有统计学意义(P=0.029);造模成功的移植瘤体积走势图显示移植瘤生长速度雄性组大于雌性组.结论 人肝癌细胞HepG2接种于BALB/C裸小鼠成瘤率及移植瘤生长速度有明显的性别差异.
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IL-18基因转染对小鼠卵巢癌OVHM体外增殖及体内成瘤的影响
目的:分析转染IL-18基因后,对小鼠卵巢癌OVHM细胞体外增殖、凋亡及体内成瘤的影响,初步探讨IL-18基因转染治疗卵巢癌的应用价值.方法:将逆转录病毒携带的小鼠IL-18基因成功转染至OVHM(OVHM/IL-18),以空载体转染的OVHM(OVHM/LXSN)和野生型(OVHM)作为对照.分别采用MTT、FCM检测体外培养细胞的增殖、凋亡及周期分布.于裸鼠皮下分别接种细胞,观察各组种植瘤生长情况,计算成瘤率;RT-PCR检测瘤组织中IL-18 mRNA表达;FCM和电镜分析肿瘤细胞增殖、凋亡状况.结果:3组细胞的体外增殖未见明显差异,均无明显凋亡现象,增殖指数、细胞周期分布均无明显差异(均P>0.05).接种后,3组裸鼠的成瘤率相同,但OVHM/IL-18组成瘤时间较晚,随瘤龄增长肿瘤生长缓慢,瘤组织中IL-18 mRNA阳性表达.OVHM/IL-18组裸鼠种植瘤细胞可见典型的凋亡现象,G0/G1期细胞明显增多,S期细胞明显减少,增殖指数明显降低,凋亡指数明显增高(P<0.01).结论:IL-18基因成功转染后,虽对体外卵巢癌细胞无直接毒性,但可能在体内借助非直接杀伤的其他途径,通过阻断细胞周期、促进肿瘤细胞凋亡等抑制体内成瘤.
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表达EB病毒潜伏膜蛋白2的C3-GFP-LMP2肿瘤细胞模型构建及免疫效果初探
目的 构建表达EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)潜伏膜蛋白2(LMP2)与绿色荧光蛋白(GFP)的C3-GFP-LMP2肿瘤细胞模型,观察肿瘤形成及LMP2特异性细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)杀伤肿瘤细胞的效果.方法 利用Lenti-X HTX慢病毒包装系统,构建携带LMP2及GFP基因的C3-GFP-LMP2肿瘤细胞.用Western blot及流式细胞术鉴定EBV LMP2蛋白表达及细胞纯度.用iCELLigence系统实时监测LMP2特异性小鼠脾脏淋巴细胞杀伤肿瘤细胞效果.4×107个肿瘤细胞皮下接种C57BL/6小鼠,免疫组化及荧光显微镜观察肿瘤组织中EBV LMP2及GFP蛋白表达.结果 C3-GFP-LMP2肿瘤细胞可以很好地表达LMP2和GFP蛋白,连续传代30次,细胞纯度仍可达94.8％;且LMP2特异性小鼠脾脏淋巴细胞杀伤C3-GFP-LMP2后细胞指数明显下降;此外,接种肿瘤细胞的小鼠均可形成肿瘤,很好地表达LMP2和GFP蛋白.结论 C3-GFP-LMP2肿瘤细胞模型可以稳定地表达EBVLMP2和GFP蛋白,有效地被LMP2特异性CTL杀伤,接种小鼠可以很好地形成肿瘤组织.该研究为EBV LMP2相关疫苗的抗肿瘤效果评价提供了候选肿瘤细胞.
