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消旋-3-正丁基苯酞对帕金森病大鼠脑组织Bax、Caspase-8和TH表达的影响
目的：观察消旋-3-正丁基苯酞（丁苯酞）对帕金森病（PD）模型鼠黑质Bax、Caspase-8、TH表达的影响，进一步明确丁苯酞对PD模型鼠脑保护作用及其机制。方法90只SD大鼠随机分为三组，模型PD对照组30只：采用立体定向注入6-羟多巴法造模；消旋-3-正丁基苯酞组30只：立体定向注入6-羟多巴，对模型鼠进行丁苯酞灌胃4周；正常对照组30只：立体定向注入抗坏血酸生理盐水。各组动物处死后行脑组织快速冰冻切片并采用免疫组化法分别检测黑质的Bax、Caspase-8、TH阳性细胞数，用原位杂交法分别检测Bax mRNA、Caspase-8 mRNA、TH mRNA的阳性细胞数。结果 NBP组免疫组化法分别检测黑质的Bax、Caspase-8、TH阳性细胞数分别为35.1±6.4，21.4±5.7，95.8±9.4；原位杂交法分别检测Bax mRNA、Caspase-8 mRNA、TH mRNA的阳性细胞数分别为23.7±6.3，16.9±7.3，48.8±7.5。与PD组相比，消旋-3-正丁基苯酞组免疫组化和原位杂交均显示术侧黑质Bax、Caspase-8阳性神经元数量较PD组均明显降低。而TH阳性神经元数量较PD组明显增多。结论正丁苯酞对PD模型鼠脑有保护作用且可能与降低Bax、Caspase-8的表达，增加TH的表达有关。
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高血压心肌肥厚患者心脏交感神经分布与勿动蛋白A表达变化的关系
目的 探讨高血压心肌肥厚患者心脏交感神经分布与神经元轴突生长抑制因子勿动蛋白A(neurite outgrowth inhibitor-A,Nogo A)的表达变化.方法 从我院老年患者尸体标本库中,随机入选男性高血压患者10例,并根据患者去世前1周心脏超声结果分为心肌肥厚组4例和非心肌肥厚组6例.检测超声心动图,并计算左心室重量指数.免疫组织化学分析测定酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)与Nogo A的表达.结果 与非心肌肥厚组比较,心肌肥厚组患者室间隔厚度、左心室后壁厚度、左心室重量指数明显升高(P＜0.05)；心肌肥厚组患者心肌TH阳性表达明显降低[(6.35±3.85)％ vs(22.17±8.19)％,P＜0.05],Nogo-A表达明显增加[(11.34±7.16)％ vs(2.17±4.10)％,P＜0.05].心肌肥厚患者心肌Nogo A表达与心肌TH表达呈负相关(r=-0.33,P＜0.05).结论 老年高血压心肌肥厚患者心肌交感神经分布减低,然而心肌神经元轴突生长抑制因子Nogo-A表达增加,两者间存在密切相关性.
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人酪氨酸羟化酶和神经营养因子双转基因工程细胞对原代多巴胺能神经元的保护作用
目的将人的酪氨酸羟化酶(hTH)和胶质细胞源性神经营养因子(hGDNF)基因共同转染SH-SY5Y细胞,筛选可同时高效稳定表达TH和GDNF的工程细胞,探讨其在帕金森病(PD)基因治疗中的作用. 方法将hTH和hGDNF cDNA插入表达载体pcDNA3.0和pcDNA3.1,构建重组真核表达载体pcDNA3.1/hGDNF和pcDNA3.0/hTH,然后转染至SH-SY5Y细胞系,利用RT-PCR鉴定和筛选出高效稳定表达阳性克隆.将此工程细胞与大鼠原代多巴胺能神经元共培养,免疫细胞化学检测观察多巴脂能神经元的数目和生长状态. 结果 (1)双转基因工程细胞可防止多巴脂能神经元退变死亡,与对照组比较,神经元数目多提高了2.8倍(P＜0.01);(2)工程细胞可抵抗N-甲基-苯基吡啶(MPP+)对多巴脂能神经元的毒性损伤作用,与对照组比较,细胞数目增加了83.6%(为7.6倍,P＜0.01). 结论首次成功建立了可同时高效稳定表达人TH和GDNF双基因的工程细胞,对多巴脂能神经元有防、治兼顾的保护作用.
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培高利特对大鼠纹状体神经营养活性的影响
目的观察培高利特(pergolide)对大鼠纹状体神经营养活性的影响. 方法取1 d的新生大鼠中脑腹侧细胞悬液,将其接种于24孔培养板中进行培养.实验分4组:单纯培养组及3个实验组,实验组为分别向培养液中加入经生理盐水、培高利特及培高利特+氨黄酰基苯甲酰胺化合物(sulpiride)腹膜内注射7 d后的大鼠纹状体提取液.培养7 d后, 应用酪氨酸羟化酶免疫组化法检测并比较各组多巴胺(DA)能神经元的生长状态. 结果实验组的各培养孔内的酪氨酸羟化酶(TH)阳性神经元及其细胞突起的数量增多,长度增加,与单纯培养组[TH阳性细胞数为382,第1级突起数为0.8±0.1,长突起长度为(11.7±0.9) μm]比较,差异均有显著性(P<0.05),其中尤以培高利特组的变化更为明显(TH阳性细胞数分别为1520,第1级突起数为2.7±0.2,长突起长度为[92.1±3.7)μm],而生理盐水组与培高利特+Sulpiride组之间差异无显著性(P＞0.05). 结论培高利特能促进纹状体神经营养活性,其机制可能与刺激DA D2受体有关.
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帕金森病大鼠黑质致密部IgG蛋白的表达变化
目的 研究帕金森病(Parkinson disease,PD)模型大鼠黑质致密部免疫球蛋白G(immunoglobulin G,IgG)的表达变化,探讨其在PD发病中的作用.方法 经单侧微量注射神经毒素6-羟多巴胺(6-hydroxydopamine,6-OHDA)制备PD大鼠模型.采用免疫组化方法检测对照组大鼠双侧、模型组大鼠健侧及损毁侧黑质致密部酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)阳性神经元、IgG阳性细胞数目及积分光密度值(integrated option density,IOD)比值的变化.结果 模型组PD大鼠损毁侧TH阳性神经元数量较健侧明显减少(P＜0.01),正常组大鼠和模型组大鼠黑质致密部均有IgG阳性细胞存在,但是模型组大鼠损毁侧致密部IgG阳性细胞数量明显增加(P＜0.01),染色深.结论 PD大鼠黑质致密部细胞IgG蛋白表达增加,表明IgG参与了PD的发生.
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TauN368和磷酸化α-synuclein在3种帕金森病动物模型脑区的表达
目的 探讨3种不同帕金森病(Parkinson disease,PD)动物模型黑质、纹状体和海马中磷酸化α-sy-nuclein(S129)〔以下简称为p-α-syn(S129)〕和天冬酰胺内切酶(asparagine endopeptidase,AEP)特异性切割产生的tauN368片段的表达水平.方法 建立慢性1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四羟吡啶(MPTP)诱导的PD小鼠模型(n=10)、鱼藤酮诱导的小鼠PD模型(n=10)以及鱼藤酮诱导的大鼠PD模型(n=10)共3种模型,每种模型均设立对照组(n=10).采用酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)免疫染色评估不同PD动物模型黑质多巴胺能神经元损伤情况,采用Western blot方法检测各组动物中脑黑质、纹状体、海马p-α-syn(S129)和tauN368的表达.结果 3种PD动物模型中脑黑质致密部TH阳性神经元数目均较对照组明显减少,提示造模成功.Western blot检测结果显示,MPTP诱导的小鼠PD模型黑质、纹状体及海马tauN368表达均较对照组升高(P<0.05),黑质和海马p-α-syn(S129)表达无统计学差异(P>0.05);鱼藤酮诱导的小鼠PD模型黑质及纹状体p-α-syn(S129)和tauN368表达均较对照组增加(P<0.05),而海马p-α-syn(S129)和tauN368表达与对照组比较均未见统计学变化(P>0.05);鱼藤酮诱导的大鼠PD模型黑质、纹状体及海马p-α-syn(S129)表达较对照组增加(P<0.05),而黑质和海马tauN368的表达无统计学差异(P>0.05).结论 鱼藤酮诱导的小鼠PD模型黑质和纹状体同时存在tauN368和p-α-syn(S129)的差异性表达,提示该模型可能是研究PD发病中tauN368和α-sy-nuclein相互作用机制的理想动物模型.
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四氢原小檗碱对吗啡依赖大鼠脑内相关核团多巴胺D1、D2受体基因表达的影响
目的研究吗啡依赖对大鼠中脑边缘多巴胺(DA)系统内相关核团DA受体的影响及四氢原小檗碱(THPB)对其的效应.方法将30只SD大鼠随机分为5组,每组6只.正常对照组始终给予等量生理盐水腹腔注射,4组建立吗啡依赖模型.以5 mg/kg开始腹腔注射,2次/d,每次递增5 mg,一直增至第10天每次50 mg/kg;第11天起对其中的两组分别注射生理盐水12 d(Mor+NS12组)和30 d(Mor+NS30组),另两组分别注射30 mg/kg THPB 12 d(Mor+THPB 12组)和30 d(Mor+THPB 30组).分别测定中脑腹侧被盖区(VTA)等脑结构酪氨酸单氧化酶(TM)免疫阳性神经元的平均吸光度(A)值、D1R mRNA和D2R mRNA水平.结果与正常对照组相比,Mor+NS组大鼠VTA的TM表达持续增高(P<0.01).治疗12 d时,Mor+NS12组D1R mRNA在伏隔核、杏仁核、尾壳核、前额叶皮质的含量和D2R mRNA在VTA、尾壳核、伏隔核的含量均低于正常对照组(P<0.01),而Mor+THPB12组在伏隔核、杏仁核、尾壳核的D1R mRNA含量和VTA、尾壳核的D2R mRNA的含量与正常对照组的差异无显著性.治疗30 d时,Mor+NS30组D1R mRNA(除杏仁核外)和D2R mRNA在各脑区的含量仍低于正常对照组(P<0.01);而Mor+THPB30组D1R mRNA除前额叶皮质外的含量和D2R mRNA的含量已至正常水平.结论 THPB能抑制阿片依赖状态下VTA的TM免疫阳性神经元的过度反应,增强脑内D1R mRNA、D2R mRNA基因的表达,加速戒断后脑内DA神经系统功能恢复的过程.
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精神分裂症患者致炎性细胞因子和酪氨酸羟化酶mRNA表达水平的研究
目的 探讨精神分裂症的外周神经免疫机制及其与临床症状的关系.方法 检测精神分裂症患者致炎性细胞因子白介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)以及酪氨酸羟化酶(TH)的mRNA表达水平,采用逆转录-聚合酶链反应及半定量检测技术,分别检测39例精神分裂症患者(患者组)、25例同胞(同胞组)及30名正常对照(对照组)外周血单个核细胞(PBMC)IL-1β、TNF-α及TH基因表达水平,同时应用阳性和阴性症状量表(PANSS)评定精神分裂症患者临床症状.结果 患者组、同胞组及对照组IL-1β的mRNA表达水平分别为1.52±1.01、1.52±1.09和0.74±0.38;TNF-α的mRNA表达水平分别为1.18±0.99、1.01±0.87和0.70±0.29;TH的mRNA表达水平分别为0.55±0.33、0.61±0.32和0.28±0.20.患者组和同胞组的IL-1β、TNF-α、TH的mRNA表达水平均明显高于对照组(P＜0.05或P＜0.01).患者组IL-1β(r=0.420)、TNF-α(r=0.430)的mRNA表达水平与PANSS的一般病理症状分呈正相关(P＜0.01).同胞组与对照组合并统计,IL-1β与TNF-α的mRNA表达水平呈正相关(r=0.847,P＜0.01);IL-1β与TH的mRNA表达水平呈正相关(r=0.666,P＜0.01).患者组仅IL-1β与TNF-α的mRNA表达水平呈正相关(r=0.942,P＜0.01).结论 精神分裂症患者PBMC细胞TH、IL-1β和TNF-α的mRNA表达水平高于正常,且与精神分裂症的一般病理症状显著相关.
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自拟控颤汤对帕金森病大鼠黑质神经元保护作用的实验研究
目的 探讨自拟控颤汤对帕金森病大鼠黑质神经元保护作用的机制.方法 利用立体定向仪向SD大鼠黑质内注射6-羟基多巴胺成功复制帕金森病大鼠模型,大鼠共分为四组:模型组(n=10)、多巴丝肼治疗组(西药组,n=10)和自拟控颤汤治疗组(中药组,n=10)以及对照组(n=8,未造模),给药后第14天和第28天进行旋转行为学测试,术后4周取大鼠的术侧中脑黑质利用免疫组化检测酪氨酸羟化酶(TH)免疫阳性细胞的表达,并进行统计学分析,判断疗效.结果 中药组和西药组帕金森病大鼠治疗后第14天和第28天均较治疗前旋平均转速降低,差异有统计学意义(P<0.05),而模型组治疗前后则无变化;与对照组细胞数(112.34±14.46)比较,模型组TH阳性细胞数(49.83±11.74)显著减少,差异有统计学意义(P<0.05);与模型组比较,西药组和中药组TH阳性细胞数(86.29±12.28、67.45±13.80)显著增加,差异有统计学意义(P<0.05).结论 自拟控颤汤能改善帕金森病大鼠旋转行为,并参与大鼠黑质多巴胺能神经元保护作用,通过实验研究进一步验证了自拟控颤汤对帕金森病的治疗效果.
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应用鱼藤酮制作帕金森病大鼠模型
目的 探讨更简便、更稳定的鱼藤酮诱导帕金森病大鼠模型的制作方法.方法 制作鱼藤酮葵花油乳化液,分别通过连续1周、2周及3周背部皮下注射鱼藤酮(1.5 mg·kg-1·d-1)的方法给三组雄性SD大鼠用药,并与正常对照组及葵花油对照组比较,于1周、2周及3周分别观察并评价相应的三个鱼藤酮组的大鼠的行为学、中脑黑质的病理学以及酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)的免疫活性的改变.结果 低剂量(1.5 mg·kg-1·d-1)长期背部皮下注射鱼藤酮可诱导雄性SD大鼠出现行为学、中脑黑质的病理学以及TH的免疫活性的改变,其变化程度均与持续用药时间密切相关.行为学评分神经功能缺损评分(mNSS)在三个模型组与两个对照组之间以及三个模型组两两之间的比较均有统计学差异(P<0.05),且评分与用药时间的相关系数为0.848;在病理学上,与两对照组相比,三个模型组中脑黑质神经元数量减少,残存神经元变性,可见嗜酸性小体;在TH免疫活性上,与正常对照组相比,三个模型组的大鼠黑质的TH阳性细胞均明显减少(t=29.882、44.799、59.697,P=0.000、0.000、0.000),均有统计学差异,且TH阳性细胞计数与用药时间的相关系数为-0.958.此模型成功率为62.5%,死亡率为18.75%,18.75%的大鼠对鱼藤酮不敏感.结论 以1.5 mg·kg-1·d-1的鱼藤酮剂量对雄性SD大鼠进行诱导,持续用药3周可成功制作出鱼藤酮帕金森病大鼠模型,且该模型操作简便、费用少、成功率高.
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灵芝孢子粉对帕金森病模型鼠黑质酪氨酸羟化酶的影响
目的研究灵芝孢子对帕金森病(PD)模型鼠脑黑质酪氨酸羟化酶(TH)的影响,以探讨灵芝孢子对PD的脑保护作用.方法 120只SD大鼠随机分为三组,PD组:立体定向注入6-羟多巴(6-OHDA),术后1周腹腔注入阿朴吗啡观察30 min大鼠旋转的次数,连续至第四周每分钟大于6次者为成功的PD模型;灵芝孢子组:先用灵芝孢子粉灌胃3 d,立体定向注入6-OHDA,继续灌胃4周,直至处死;正常对照组:立体定向注入脑黑质抗坏血酸生理盐水.处死后制作快速冰冻切片用免疫组化检测TH阳性细胞数,用原位杂交法检测TH mRNA的阳性细胞数,用Western blot检测TH的半定量变化,用高效液相色谱检测多巴胺水平的变化.结果免疫组化显示灵芝孢子组术侧鼠脑黑质TH阳性神经元数量为99.7±13.6,PD组为51.0±13.5,灵芝孢子组较PD组显著升高(P＜0.05);原位杂交显示灵芝孢子组术侧鼠脑黑质TH mRNA阳性神经元数量为180.3±24.3,PD组为72.7±15.0,灵芝孢子组较PD组显著升高(P＜0.01);Western blot检测显示TH蛋白灵芝孢子组较PD组显著增加;高效液相色谱检测术侧鼠脑黑质多巴胺(DA)水平灵芝孢子组为(0.7±0.3) ng/mg蛋白,PD组为(0.4±0.1) ng/mg蛋白,灵芝孢子组较PD组显著升高(P＜0.05).结论灵芝孢子能够提高TH的表达,并提高鼠脑黑质DA的水平,推测对6-OHDA 诱导的PD可能有脑保护作用.
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红景天甙促进帕金森病模型小鼠表达内源性胶质细胞源性神经营养因子蛋白保护多巴胺能神经元
目的 研究中药单体成分红景天甙(salidroside)对1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)诱发的帕金森病(Parkinson disease,PD)小鼠模型的脑保护作用及其可能机制.方法 80只C57BL雄性小鼠,分为正常对照组、MPTP模型组、MPTP+红景天甙组(即干预组,分别用3 mg/kg、50mg/kg和150 mg/kg)及红景天甙对照组(分别用3 mg/kg、50 mg/kg和150 mg/kg),每组10只.应用免疫组化法观察黑质酪氨酸羟化酶(TH)阳性神经元数目变化,蛋白印迹法(Western blot)检测TH、胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)在纹状体中表达水平的变化.结果 在小鼠黑质部位,MPTP组TH阳性神经元数目明显少于正常对照组及干预组(P＜0.05).Westernblot结果显示,不同剂量干预组小鼠纹状体中的TH蛋白表达(相对灰度值)(0.8326±0.0930,0.9007±0.0104和1.1114±0.2013)较MPTP组的TH蛋白表达(0.5738±0.0114)明显增加(P＜0.05);干预组的GDNF蛋白表达(1.3503±0.0573)较MPTP组的蛋白表达(0.1485±0.0118)显著增加(P＜0.05);干预组的GFAP蛋白表达(2.4788±0.2093)与MPTP组(1.8431±0.1559)之间差异无统计学意义(P＞0.05),但是干预组较正常对照组(1.3695±0.1174)明显增加(P＜0.05).结论 红景天甙可以拮抗MPTP诱导的PD模型小鼠黑质多巴胺能神经元的丢失,其神经保护作用可能与促进内源性GDNF分泌增加有关.
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14-3-3蛋白与阿尔茨海默病tau蛋白异常磷酸化的关系
目的研究阿尔茨海默病(Alzheimer disease, AD)患者海马组织14-3-3蛋白家族与神经原纤维缠结(NFT)形成及 tau蛋白异常磷酸化之间的关系.方法以4例临床及病理确诊的AD患者及4名对照者海马组织为材料,用免疫组织化学、免疫印迹及免疫共沉淀技术来研究14-3-3蛋白在AD患者海马的表达情况及其与异常磷酸化tau蛋白之间的关系.结果 14-3-3蛋白ζ及γ亚型能使AD患者海马的NFT显色,β亚型主要使海马的颗粒神经元着色,同时也使少许NFT染色.免疫印迹显示β和ζ亚型在AD中明显上调,其像素值(分别为4570±92和5630±40)比对照组(分别为1849±65和956±140)高2～3倍(P<0.01,t检验).免疫共沉淀分析发现单抗双螺旋细丝(PHF-1)从AD患者脑中沉淀的14-3-3蛋白像素值(3859±78)显著多于对照组(1540±138,AD组像素值比对照组高1倍,P<0.05,t检验),这3种亚型均与异常磷酸化tau蛋白在AD患者脑部形成复合物.σ亚型在AD患者和对照组脑中均无表达.上述发现在4名对照者脑组织中并未观察到.结论β、ζ及γ亚型14-3-3蛋白参与NFT形成,它们均可能参与tau蛋白的磷酸化调节,具体机制有待阐明.
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多巴反应性肌张力障碍长期随访四例
目的 总结多巴反应性肌张力障碍(dopa-responsive dystonia,DRD)的临床特点,探讨其治疗效果、随访结果及三磷酸鸟苷环化水解酶Ⅰ (GCH Ⅰ)基因、酪氨酸羟化酶(TH)基因突变情况.方法 总结3个DRD家系共4例患者的临床资料,并对患者行GCH Ⅰ基因及TH基因检测.结果 4例患者均为女性,起病年龄为9 ～ 20(15.3±5.6)岁,均以双下肢僵硬、抖动起病,随病程进展其中3例出现双手抖动症状,1例患者出现全身扭转,1例患者合并有斜颈,4例患者均有晨轻暮重的表现.对4例患者进行小剂量左旋多巴治疗,随访半年至10年不等,患者均有持续、明显的疗效；且随时间延长所需剂量减少,无长期服用左旋多巴不良反应.对4例患者行GCH Ⅰ基因全长外显子突变检测,1例患者呈GCH Ⅰ基因杂合点突变c.607G＞A(p.Gly203 Arg),1例患者为TH基因14号外显子复合杂合突变(p.Y447Ter及p.V468M),余患者未见GCH Ⅰ基因及TH基因全长外显子点突变.结论 长期随访发现小剂量左旋多巴对DRD患者具有显著而持久的疗效,且无明显副作用.GCH Ⅰ基因及TH基因的检测可对DRD进行早期诊断,对于儿童期或青少年期起病的肌张力障碍患者,无论有无家族史,均需行小剂量多巴胺诊断性治疗.
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心理应激对中枢多巴胺能神经元的影响及酪氨酸的干预作用
目的观察反复心理应激对中枢多巴胺(DA)系统的影响及酪氨酸(Tyr)的干预作用.方法用Communication Box模型对大鼠进行连续14天、每天30min的心理应激,并经饲料给予250、500、1 000mg/kg三个剂量Tyr的干预.应激后对含中脑腹侧被盖区(VTA)、伏隔核(Nac)及前额皮质(mPFC)的脑组织切片进行酪氨酸羟化酶(TH)和Fos蛋白免疫组化染色.结果心理应激组在前囟后5.1mm处VTA部位TH阳性神经元数比正常对照组下降显著(P＜0.01);在5.1、5.4、5.7mm处VTA部位,Tyr干预500、1 000mg/kg组TH阳性神经元数升高.Fos蛋白在VTA、Nac、mPFC等三个部位均有较强的表达,且心理应激组较对照组明显升高,1 000mg/kg Tyr干预组较心理应激组明显降低.结论反复心理应激能够损害中枢DA神经元,导致TH阳性神经元数目减少,Fos蛋白表达增加,多巴胺前体物质Tyr的干预能够降低此种损害.
关键词： 应激 心理学 酪氨酸单氧化酶 原癌基因蛋白质c-fos 多巴胺 -
CT引导脑内植入携带人类酪氨酸羟化酶基因腺相关病毒载体治疗实验性帕金森病猴
目的观察CT引导脑内注射人类酪氨酸羟化酶基因腺相关病毒载体(AAV-hTH)对神经细胞的转染能力,以及对帕金森病(PD)猴的治疗效应.方法经右侧颈内动脉注射1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)制作6只偏侧帕金森病恒河猴模型,经CT引导将AAV-hTH注入5只帕金森病猴右侧尾状核内,观测猴模型的行为学改变6个月以上,以高效液相色谱法(HLPC)测定转染后尾状核内多巴胺(DA)及其代谢产物含量,并以免疫组化检测法及逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法检测酪氨酸羟化酶(TH)基因的表达情况.结果 CT引导定位穿刺有实时操作、定位精确、微创的优点.所有注射AAV-hTH的偏侧PD猴模型术后2周即有帕金森病症状改善,持续6个月以上,其中1只动物阿朴吗啡旋转实验示完全停止了帕金森病旋转现象,其余动物旋转次数较术前减少约42%～70%.实验侧与健侧尾状核区多巴胺及其代谢产物含量比值较未治疗模型增高.免疫组化染色见穿刺针道部位有大量TH阳性细胞;RT-PCR检测到实验侧尾状核区有TH-mRNA存在;而对照侧尾状核区、其他部位脑组织与心、肝、肾组织及未注射模型实验侧尾状核区均未见阳性发现.结论 CT引导立体定向穿刺PD猴尾状核注入AAV-hTH能使TH基因精确地在特定部位有效表达, 提高尾状核区DA含量, 改善模型猴症状,研究结果提示这是一种有效、安全的治疗PD非人类灵长类动物模型的方法.为临床基因治疗PD的研究提供了实验研究依据.
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外源性犬尿喹啉酸对黑质多巴胺能神经元损伤保护作用的实验研究
目的:观察评价预先应用谷氨酸(Glu)受体拮抗剂犬尿喹啉酸(KYNA)对黑质多巴胺(DA)能神经元及神经传导纤维损伤的保护性作用. 方法:雌性SD大鼠 40 只,随机分为 4 组,每组 10 只,应用江湾I型C立体定向仪,在单侧黑质致密部(SNc)及中脑被盖腹侧部(VTA), A组注射生理盐水,B组注射KYNA,C组注射KYNA和6-OHDA, KYNA先于6-OHDA 0.5 h, D组注射6-OHDA.注射药物 3 d 后,进行症状观察,2 周后处死大鼠.切片HE染色观察黑质细胞的形态特点,冰冻切片免疫组化特殊染色观察TH阳性细胞及TH阳性纤维着色情况,实验数据分别采用方差分析以及秩和检验进行统计分析.结果:正常黑质细胞体形较大,富含黑色素颗粒,可见尼氏体.数据统计分析结果提示B组与A组之间无显著影响,P>0.05.实验组C与A、B、D组比较均有显著性差异, P<0.01.结论:外源性谷氨酸受体拮抗剂KYNA通过阻滞Glu受体能减轻6-OHDA诱导的黑质DA能神经元毒性损害.
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姜黄素对帕金森病小鼠模型黑质多巴胺能神经元损伤的保护作用
目的 研究姜黄素对由MPTP诱发的帕金森病小鼠模型的脑保护作用及其可能机制.方法 应用免疫组织化学染色法和蛋白质印迹法(Western blotting)分别观察姜黄素干预前后帕金森病小鼠中脑黑质-纹状体系统中酪氨酸羟化酶、胶质纤维酸性蛋白阳性神经元数目的变化,以及酪氨酸羟化酶、诱导型一氧化氮合酶和胶质纤维酸性蛋白表达水平的变化.结果 MPTP组小鼠中脑黑质酪氨酸羟化酶和胶质纤维酸性蛋白阳性神经元数目明显减少,与正常对照组及治疗组相比差异有统计学意义(均P＜0.05).经不同剂量(5mg/kg、50mg/kg和150mg/kg)的姜黄素干预治疗后,小鼠中脑纹状体中的酪氨酸羟化酶蛋白表达水平(相对灰度值)明显升高,而黑质中诱导型一氧化氮合酶和胶质纤维酸性蛋白表达水平明显降低,与MPTP组比较差异均有统计学意义(P＜0.05);MPTP组与溶剂对照组(MPTP+DMSO)之间差异无统计学意义(P＞0.05).结论 姜黄素可以有效地拮抗MPTP诱导的帕金森病小鼠模型黑质多巴胺能神经元的丢失,其机制可能与姜黄素降低黑质多巴胺能神经元活性氧含量以及抑制炎症反应等作用有关.
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Th17和Treg细胞来源的儿茶酚胺在胶原诱导性关节炎中的作用
目的：探讨胶原诱导性关节炎（CIA）疾病发生发展过程中Th17和Treg细胞来源的儿茶酚胺（CAs）的作用。方法随机将18只雄性DBA/1小鼠分为对照组、CIA模型Ⅰ组（35 d）和CIA模型Ⅱ组（55 d）。Ⅱ型胶原乳剂尾根部注射制备CIA小鼠模型。Real-time PCR法检测淋巴结中Th17细胞的特异性转录因子ROR-γt，相关细胞因子IL-17和IL-22，Treg细胞的特异性转录因子Foxp3，相关细胞因子转化生长因子（TGF）-β以及酪氨酸羟化酶（TH）的mRNA表达。免疫荧光组织化学染色法观察淋巴结中ROR-γt和Foxp3分别与TH、囊泡单胺转运体-2（VMAT-2）和单胺氧化酶（MAO）的共定位情况。结果与对照组相比，CIA模型Ⅰ组和模型Ⅱ组的小鼠淋巴结中ROR-γ、IL-17、TH和IL-22的mRNA表达增加；Foxp3和TGF-β的mRNA表达减少；其中模型Ⅱ组IL-17的mRNA表达与模型Ⅰ组相比有所降低。对照组和CIA模型Ⅰ组及模型Ⅱ组的小鼠淋巴结中存在ROR-γt和Foxp3分别与TH、VMAT-2和MAO的共定位细胞。CIA模型组小鼠淋巴结中ROR-γt/TH、ROR-γt/VMAT-2和ROR-γt/MAO双阳性细胞数增加，模型Ⅱ组中的这些双阳性细胞数与模型Ⅰ组相比有所减少。结论 CIA模型组小鼠淋巴结中Th17细胞合成CAs的能力增强，这种Th17细胞来源的CAs的增加可能在CIA的发生发展过程有一定的抗炎作用。
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重组慢病毒携带酪氨酸羟化酶对大鼠帕金森病模型的干预研究
目的 利用携带大鼠酪氨酸羟化酶(TH)基因的重组慢病毒,对大鼠帕金森病模型进行基因治疗,评估基因疗法对帕金森病症状缓解和黑质神经元恢复的影响.方法 2014年11月—2015年12月,分离、培养和鉴定胎鼠原代神经元,抽提胎鼠原代神经元RNA、反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)克隆大鼠TH(rTH)基因,将rTH基因构建至慢病毒质粒,包装rTH重组慢病毒.采用实时荧光定量RT-PCR、免疫荧光实验和Western blotting法体外检测大鼠成纤维细胞REF中rTH基因表达.通过脑内立体定位注射6羟多巴胺(6-OHDA)建立大鼠帕金森病模型,给予Lv-rTH重组慢病毒(Lv-rTH治疗组)、未携带基因的慢病毒Lv-NC(Lv-NC治疗组)及0.9%氯化钠溶液(对照组)注射大鼠纹状体和黑质.通过阿扑吗啡诱发旋转实验进行行为学评分,免疫组化进行神经元恢复评分.结果 成功分离、培养了胎鼠原代神经元,成功克隆了rTH基因,并将rTH基因构建至慢病毒质粒,实时荧光定量RT-PCR、免疫荧光实验和Western blotting法检测大鼠成纤维细胞REF中均表达rTH基因.3组大鼠治疗前1周自发旋转速率比较,差异无统计学意义(P>0.05);3组大鼠治疗0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10周自发旋转速率比较,差异均有统计学意义(P<0.05);其中治疗0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10周,Lv-NC治疗组和Lv-rTH治疗组大鼠自发旋转速率较对照组增快(P<0.05);治疗2、3、5、6、8、9、10周,Lv-rTH治疗组大鼠自发旋转速率较Lv-NC治疗组减慢(P<0.05).Lv-NC治疗组和Lv-rTH治疗组大鼠中脑黑质TH阳性神经元所占比例较对照组降低, Lv-rTH治疗组大鼠中脑黑质TH阳性神经元所占比例较Lv-NC治疗组升高(P<0.05).结论 通过脑内立体定位注射,将表达rTH基因的重组慢病毒递送至帕金森病大鼠纹状体和黑质能缓解帕金森病症状并恢复TH阳性神经元.
