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热休克蛋白110对人乳头瘤病毒16型E711-20配体的佐剂效应研究
目的 探讨热休克蛋白(HSP)110对人乳头瘤病毒(HPV)16型E711-20配体的免疫佐剂效应.方法 体外构建HSP 110与HPV 16型E711-20配体的复合物.将C57BL/6雌性6周龄小鼠15只随机分为3组:复合物组、配体组和磷酸盐缓冲液(PBS)组,每组5只,腹腔注射免疫复合物100 μg,肽10μg,PBS100μl,2周后重复1次,第2次免疫2周后,分离脾细胞作为效应细胞.免疫小鼠后采用噻唑蓝法(MTT)判断脾淋巴细胞增殖活性,干扰素γ(IFN-γ)胞内染色法检测小鼠脾细胞中特异性细胞毒T淋巴细胞,并以标准51Cr释放实验检测特异性细胞毒T淋巴细胞对靶细胞的杀伤效应.采用SPSS10.0软件进行t检验.结果 HSP110与HPV16型E711-20配体的复合物免疫小鼠后脾淋巴细胞增殖活性(增殖指数为1.87±0.12)和CD8+ IFN-γT细胞的频率(3.9％)显著高于配体组(分别为0.32±0.071和0.4％),差异均有统计学意义(P＜0.01).配体的复合物对靶细胞的杀伤效应(效靶比为100∶1、50∶1、25∶1、12.5∶1时,杀伤率分别为54.7％、72.2％、61.5％、39.8％)显著高于配体组(分别为35.2％、49.3％、28.1％、17.4％).结论 HSP110能增强HPV16型711-20配体的免疫效应,具有较好的免疫佐剂作用.
关键词： HSP110热休克蛋白质类 人乳头瘤病毒16 修饰多肽配体 -
稳定表达人乳头瘤病毒16E7蛋白HaCaT细胞株的建立
目的建立稳定表达人乳头瘤病毒(HPV)16E7蛋白的HaCaT细胞株.方法利用PCR及酶切技术扩增出CaSki细胞中HPV16E7基因并定向克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1(+)中,构建真核表达质粒pcDNA3.1(+)-HPV16E7.将重组质粒转染入HaCaT细胞,经G418筛选稳定表达HPV16E7蛋白的细胞株并予以鉴定.结果经酶切、测序鉴定构建pcDNA3.1(+)-HPV16E7成功.RT-PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后检测到HPV16E7mRNA表达的特异性297 bp条带;Western印迹可检测到E7蛋白稳定表达.结论成功构建出稳定表达HPV16E7蛋白的HaCaT细胞株.
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HPV16E7多肽体外诱生抗原特异性细胞毒性T细胞表型及功能的研究
目的 探讨高致癌性HPV16E7病毒抗原肽体外诱生HLA-A2阳性正常人外周血抗原特异性CD8+细胞毒性T细胞(CTL)的表型及功能状态.方法 以HPV16E711-20合成多肽、重组人IL-7、IL-2体外刺激26例HLA-A2阳性正常人外周血T细胞,用HLA-A*0201限制性表位肽/YMLDLQPETT五聚体技术,结合流式细胞仪对抗原特异性CTL进行频率、表型[CD45RA+CD27-效应性CTL、CD45RA-CD27-效应性记忆CTL(TEM)、CD45RA-CD27+中枢性记忆CTL(TCM)、CD45+CD27+初始性CTL]及功能(穿孔素、颗粒酶B、FasL)分析,并以无关肽HBVcoxe18-27作为阴性对照.结果 病毒多肽体外刺激T细胞7 d后,抗原特异性CD8+CTL数为(0.73±0.33)%,比未刺激组的(0.02±0.03)%明显增多(P＜0.01).进一步分析,在抗原特异性CTL中,效应性CTL、TEM、TCM及初始性CTL百分比分别为(26.07±13.46)%、(7.97±7.11)%、(33.25±19.68)%及(32.73±13.89)%,均比未刺激组的(0.02±0.03)%、(0.02±0.03)%、(0.02±0.03)%及(0.02±0.05)%明显增多,P值均＜0.01.HPV16E711-20表位特异性CTL分泌穿孔素、颗粒酶B、Fas-L的水平分别为(47.01±18.69)%、(80.53±13.32)%及(26.48±7.81)%,均比未刺激组的(0.38±0.55)%、(0.34±0.22)%及(0.16±0.16)%明显增多,P值均＜0.01.结论 HPV16E711-20多肽诱导CD8+T细胞克隆扩增,产生抗原特异性CD8+CTL,分泌毒性细胞因子,通过不同机制特异性杀伤病毒感染的靶细胞,在抗病毒免疫应答中发挥作用.
关键词： 人乳头瘤病毒16 乳头瘤病毒E7蛋白质类 T淋巴细胞 细胞毒性 表型 -
人乳头瘤病毒16及其变异体感染者宫颈E6、P53、E7和视网膜母细胞瘤蛋白表达研究
目的 探讨E6、E7、P53、视网膜母细胞瘤蛋白(pRb)表达变化在HPV16单一型持续感染者宫颈病变早期进展中的作用.方法 选择2013年10月至2015年6月在上海市浦东新区人民医院宫颈疾病患者档案中登记的HPV16单一型持续阳性,但病理学正常的患者140例,行DNA序列分析检测HPV16变异体,按照是否存在变异体分为HPV16变异体组(变异体组)和HPV16非变异体组(非变异体组),随访1年对HPV16阳性者复测变异体,对同一变异体持续阳性或非变异体持续阳性者同时行宫颈活检,并用免疫组织化学法检测宫颈组织E6、E7、P53和pRb蛋白表达,进行分析比较.结果 得到同一变异体持续感染53例,非变异体持续感染51例,终得到完整的免疫组化染色结果各50例.变异体组21例进展为CIN,非变异体组19例进展为CIN,差异无统计学意义(x2=0.166,P＞0.05).50例变异体持续感染患者中,34例(68.00％)的HPV16变异体属亚洲原型(As.P),3例(6.00％)属欧洲原型(EP),4例(8.00％)属亚洲变异休,7例(14.00％)属欧洲变异体,1例(2.00％)属非洲1变异体(Af1).E7在变异体组与非变异体组CIN患者的阳性率分别为81.00％和84.21％,均高于慢性宫颈炎,差异有统计学意义(x2=12.150和19.090,P＜0.01);而pRb在两组的慢性宫颈炎患者中阳性率为82.76％和80.65％,高于CIN患者,差异有统计学意义(x2=6.912和4.402,P＜0.05).结论 在宫颈病变早期,E7可能更早参与了其发生和进展,E7表达上升且pRb表达下降对HPV持续感染患者早期宫颈病变进展可能起一定预测作用.但E6、E7、P53和pRb表达在宫颈病变进展早期变异体与非变异体感染患者间并无差异.
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表达人乳头瘤病毒16型E6E7的重组腺病毒载体疫苗种子库遗传稳定性研究
目的 了解表达人乳头瘤病毒(HPV) 16型E6和E7融合蛋白的重组腺病毒载体(Ad-HPV16E6E7)疫苗的主种子库(MSB)和工作种子库(WSB)的遗传稳定性.方法 通过显微镜检查和病毒感染效价测定实验测定Ad-HPV16E6E7 MSB和WSB的感染性滴度;采用PCR扩增法鉴定HPV16E6E7目的基因稳定性;采用Western印迹法和免疫荧光法鉴定Ad-HPV16E6E7目的蛋白表达;采用C57BL/6小鼠TC-1肿瘤细胞生长抑制试验评价Ad-HPV16E6E7的生物学效应.结果 Ad-HPV16E6E7的MSB和WSB的感染性滴度分别为6.31×109 IU/mL和3.00×109 IU/mL;插入目的基因和表达目的蛋白稳定;小鼠TC-1肿瘤生长抑制试验表明MSB和WSB滴度的数量级在109 IU/mL时,小鼠抑瘤率达100％,与对照组相比差异均有统计学意义(x2=20.00、20.00,P均＜0.01).结论 Ad-HPV16E6E7疫苗的种子库遗传稳定,符合将来疫苗研发的要求.
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氢氧化铝对人乳头瘤病毒16型L2E6E7融合蛋白免疫增强作用的初步研究
目的 初步评价Al(OH)3对重组HPV16的L2E6E7融合蛋白(简称HPV16L2E6E7)的免疫佐剂作用.方法 将108只雌性C57BL/6小鼠随机分成Al(OH)3组(85.7 μg/只,肌肉注射)、HPV16L2E6E7组(120.0μg/只,肌肉注射)、A1 (OH)3+HPV16L2E6E7组[每只 Al(OH)3 85.7μg+HPV16L2E6E7120.0μg,肌肉注射],每组36只,免疫程序为0、3、7d.ELISPOT法检测IFN-γ,间接ELISA法检测IgG抗体水平.另将40只皮下接种TC-1肿瘤细胞(1×104/只)的雌性C57BL/6小鼠随机分为PBS组(100.0 μL)、Al (OH)3组(85.7μg/只,肌肉注射)、HPV16L2E6E7组(120.0μg,/只,肌肉注射)、Al(OH)3+ HPV16L2E6E7组[每只Al(OH)385.7μg+HPV16L2E6E7 120.0μg,肌肉注射],每组10只.免疫程序为0、3、7d.观察肿瘤形成时间、体积变化及成瘤率,观察期为53 d.结果 免疫后第10、14、21、28、35和42d,HPV16L2E6E7组与Al(OH)3+HPV16L2E6E7组IgG抗体滴度都高于Al(OH)3对照组,差异具有统计学意义(P均＜0.01),免疫后21、28、35、42 d Al(OH)3+ HPV16L2E6E7组特异性IgG抗体显著高于HPV16L2E6E7组(P均＜0.01);免疫后14、21、28d Al(OH)3+ HPV16L2E6E7组E7特异性IFN-γ水平显著高于HPV16L2E6E7组(P均＜0.01);小鼠抑瘤实验中,HPV16L2E6E7组抑瘤率为60％,Al(OH)3+ HPV16L2E6E7抑瘤率为40％,两组无明显差异(P＞0.05),但与对照组比较都有显著性差异(P＜ 0.01,P＜0.05).结论 初步评价Al(OH)3能与HPV16L2E6E7较好吸附,可诱导C57BL/6雌性小鼠产生更强的特异性体液和细胞免疫应答,具有免疫增强作用.
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鸦胆子素D对HPV16感染细胞株的作用及其可能机制
目的：研究鸦胆子素D对高危型人类乳头瘤病毒（HPV）16感染细胞的增殖抑制作用、促凋亡作用及其可能机制。方法：以人宫颈鳞状上皮永生化细胞株（Ect1/E6E7）作为HPV16型感染的宫颈癌前病变的体外实验模型，用1、5、10、15、30μmol/L的鸦胆子素D分别体外作用于细胞24、48、72 h，用3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）法测定细胞增殖活性改变；以1、5、10μmol/L的鸦胆子素D分别体外作用于细胞24、48、72 h后，Cell cycle staining solution检测细胞生长周期变化，Hoechst 33258细胞核荧光染色法观察细胞凋亡情况，Annexin V-FITC/PI双染色法检测细胞凋亡率。宫颈癌细胞株Caski含有完整的HPV16型E6、E7基因序列，以此作为阳性对照，通过实时荧光定量PCR技术检测两种细胞内HPV16 E6、E7基因mRNA的表达。结果：鸦胆子素D对Ect1/E6E7细胞具有明显的抑制体外增殖作用，MTT结果显示抑制作用呈时间和浓度依赖性（P＜0.05）。经1、5、10μmol/L鸦胆子素D体外作用48 h后，细胞生长周期停滞于G1期。流式细胞仪检测显示，各实验组细胞经鸦胆子素D作用48 h后，细胞凋亡率分别为（6.25±0.76）%（、20.21±1.32）%和（8.61±1.59）%，与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。Hochest33258细胞核染色法显示细胞出现凋亡形态学改变。Real-time PCR技术检测结果显示Ect1/E6E7中HPV16 E6、E7 mRNA表达水平无明显下降，与对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。而Caski中HPV16 E6、E7 mRNA表达水平下降，与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。结论：鸦胆子素D能有效地抑制Ect1/E6E7细胞增殖，其机制可能是通过抑制HPV16 E6、E7 mRNA表达从而促进细胞凋亡。
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宫颈癌组织HPV16早期基因E6相关转录本检测方法的建立及意义
目的：建立宫颈癌组织HPV16早期基因E6相关转录本检测方法，分析宫颈癌发生各时期的HPV16早期基因E6相关转录的情况。方法：留取HPV16阳性的宫颈肿瘤组织63例，包括8例低度鳞状上皮内瘤变（LSIL）、38例高度鳞状上皮内瘤变（HSIL）和17例宫颈癌，提取RNA，利用含保守序列的RT引物将标本中的mRNA反转录成5’端含保守序列的cDNA，并利用HPV16E6特异性引物（P1）和保守序列（P0）进行PCR扩增，建立特异性扩增HPV16E6相关转录本的方法，检测标本中HPV16E6相关的转录本，通过E6特异性探针进行Southern杂交加以验证。结果：成功建立了HPV16E6相关转录模式分析的方法。经分析HPV16阳性的LSIL、HSIL及宫颈癌组织中E6转录模式结果发现，不同级别HPV16阳性的宫颈肿瘤组织的转录模式差异显著。随着LSIL向宫颈癌发展，肿瘤组织中HPV16E6转录本种类增多，且优势转录模式逐渐清晰。结论：成功建立HPV16E6相关转录模式分析的方法，并发现HPV16早期基因E6相关的转录模式与宫颈肿瘤癌变程度密切相关，其可能参与宫颈癌的发生和发展。
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人乳头瘤病毒16型E7基因的原核克隆与表达
目的:研究人乳头瘤病毒(Human papillomavirus HPV)16型E7在原核表达系统中的表达情况和活性,为制备HPV16型E7蛋白疫苗奠定实验基础.方法:通过聚合酶联反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)从HPV16 DNA阳性的宫颈癌组织中扩增HPV16 E7全长基因,进一步将其克隆入原核表达载体pET32a(+),并构建重组质粒pET32a(+)/HPV16 E7,经测序鉴定后转化大肠杆菌BL21(DE3),经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达的融合蛋白,用镍螯合亲和层析胶体(Ni-NTA Agarose)纯化,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、蛋白质印迹法(Western blot,WB)分析鉴定.结果:测序证明成功构建重组质粒pET32a/HPV16E7,IPTG诱导下HPV16E7融合蛋白在大肠杆菌中得到高效表达,重组蛋白的表达量占菌体总蛋白的16%,蛋白质印迹鉴定重组E7蛋白与表达载体的标签蛋白形成相对分子质量约30×103的可溶性融合蛋白.结论:重组质粒pET32a/HPV16E7在大肠杆菌BL21中高效表达目的蛋白.
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宫颈鳞癌人乳头状瘤病毒16/18E6感染与脆性组氨酸三联体表达状态的研究
目的 探讨官颈鳞癌中人乳头状瘤病毒(HPV)16/18 E6、脆性组氨酸三联体(FHIT)蛋白表达的情况以及两者的相关性,了解HPV16/18 E6、FHIT蛋白表达与宫颈癌临床病理参数的关系.方法 应用免疫组织化学MaxVision法对40例宫颈鳞癌组织标本和10例正常宫颈组织,进行HPV16/18 E6、FHIT蛋白表达的检测.结果 HPV16/18 E6蛋白在宫颈癌组织中比在正常宫预组织中表达明显增多,FHIT蛋白在宫颈癌组织中比在正常宫颈组织中表达明显减少,FHIT蛋白与HPV16/18 E6蛋白的表达存在相关关系.结论 FHIT蛋白缺失与宫颈鳞癌发生有关,它的缺失可能作为HPV16/18阳性高危人群的筛选指标.
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浙江省金华市人民医院妇科门诊女性感染宫颈上皮细胞人乳头瘤病毒亚型分布特征分析
目的 探讨金华市人民医院门诊女性宫颈上皮细胞人乳头瘤病毒(HPV)的感染情况及亚型分布情况.方法 采用基因芯片法对就诊的妇女进行26种HPV亚型检测,对各亚型的感染情况进行分析.结果 984例就诊患者中共检出25种HPV亚型,检出率排在前三为16型、58型、52型.HPV总阳性率为36.89％.其中高危型检出率为25.91％,低危型检出率为5.69％,多重感染率为5.28％.21～30岁、＞30～40岁、＞40岁3个年龄组中HPV检出率分别为42.33％,35.23％,35.94％.其中3个年龄组在HPV高危型检出率、低危型检出率及多重感染率差异有统计学意义(x2 =71.58,P＜0.05).结论 HPV16、58、52型是金华市人民医院就诊患者女性感染的主要高危基因型;HPV基因分型对宫颈癌的早期预防、治疗、病因学及HPV疫苗的研究具有重要意义.
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福建地区人乳头瘤病毒感染与口腔癌关系的病例对照研究
目的 研究人乳头瘤病毒(HPV)感染与口腔癌的关联. 方法 采用病例对照研究,病例为福建医科大学第一附属医院口腔颌面外科经病理确诊的新发病例75例,对照为按性别年龄频数匹配的社区人群75例.病例组采集新鲜癌组织,对照组采集口腔黏膜细胞,提取组织DNA,运用HPV基因微阵列分型方法检测21型HPV.采用非条件Logistic回归分析HPV感染与口腔癌发病风险的调整比值比(OR)及95％可信区间(95 ％CI).结果 HPV16/18感染增加了口腔癌的发病风险,其调整的OR为12.457 (95％CI:1.325～117.117).HPV感染与年龄、性别、文化程度、吸烟、饮酒有关(P＜0.05). 结论 HPV16/18感染可能是福建地区口腔癌的危险因素,HPV16/18感染与年龄、性别、文化程度、吸烟、饮酒有关.
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多重实时PCR对宫颈癌及癌前病变HPV-16病毒整合状态的检测
目的:探讨检测HPV存在状态的理想方法,了解HPV-16整合在宫颈癌发生发展中的作用及其可能的临床应用价值.方法:用多重实时PCR同管定量检测HPV-16的E2和E6基因,根据E2/E6判定HPV-16的存在状态;与Southern杂交检测结果进行比较.检测HPV-16阳性的宫颈鳞癌51例和宫颈上皮内瘤病变49例的石蜡标本.结果:(1)多重实时PCR所得HPV-16 E2、E6标准曲线的相关性好,扩增效率均高于95%;(2)确定多重实时PCR以E2/E6比值为0.81作为区分游离型和混合型HPV-16的界值;(3)多重实时PCR与Southern杂交检测的符合率为81.5%(Kappa值为0.844,P＜0.001);(4)HPV-16整合发生率与不同程度的宫颈病变有关,CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ和SCC中HPV-16整合发生率分别为42.9%、76.5%、83.3%和90.2%;(5)Ⅱ+Ⅲ期宫颈癌中整合型HPV-16所占比例(88.0%)显著高于Ⅰ期宫颈癌(33.3%).结论:多重实时定量PCR是检测HPV-16病毒存在状态的可靠方法,有准确、省时、简便快速及高通量的优点.
关键词： 人乳头瘤病毒16 多重实时聚合酶链反应 整合 宫颈肿瘤 -
RNA干扰在宫颈癌HPV16E6/E7中的研究进展
RNA干扰(RNAi)是一种有效的基因沉默过程,宫颈癌的重要基因型HPV16的关键致癌基因是E6和E7,目前RNAi在HPV16 E6/E7中的基因沉默作用已取得一些突破性进展.在体外研究方面,正在进一步确定稳定干扰目的 基因的载体形式和筛选更好的干扰序列,在体内研究方面,已建立相应的动物模型,为RNAi的临床研究打下了铺垫.
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人乳头瘤病毒分型检测在宫颈癌及癌前病变防治中的应用
人乳头瘤病毒(HPV)与宫颈癌及宫颈癌前病变的发生密切相关,并且HPV亚型不同,其致癌力、宫颈癌病理分型以及宫颈癌的预后均有所不同.早期发现官颈高危型HPV感染与准确分型,及时进行早期干预治疗,是提高宫颈癌防治效果的有效途径,临床HPV分型检测对宫颈癌及癌前病变的防治有重要意义.
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人乳头状瘤病毒16变异体研究进展
人乳头瘤病毒(HPV)16与多种肿瘤的发生相关,流行病学上揭示了其变异体的分布具有地域性和种族特性,并在病毒持续感染和疾病演变中发挥重要作用,HPV16型变异体研究是HPV及相关肿瘤研究中的重要领域.
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CRISPR/Cas系统对人宫颈癌细胞增殖与凋亡的影响及其机制探讨
目的 研究靶向于HPV16型的-E7(HPV16-E7)基因的成簇规律间隔短回文重复序列及其相关系统(CRISPR/Cas)对HPV16阳性宫颈癌细胞株SiHa增殖和凋亡的影响及其机制.方法 培养HPV16阳性的宫颈癌细胞株SiHa和HPV阴性的人胚肾上皮细胞株HEK293,分别将SiHa细胞和HEK293细胞分为3组:Cri组(按照1∶3的比例转染向导RNA与Cas9质粒)、C9组(只转染等量的Cas9质粒)和对照组(不处理).T7核酸内切酶Ⅰ法检测双链DNA断裂情况,流式细胞术检测细胞凋亡,CCK-8法评价细胞增殖,Western blotting检测E7和成视网膜母细胞瘤蛋白(pRb)表达.结果 转染48 h后,SiHa细胞Cri组PCR产物被切开.SiHa细胞Cri组凋亡率为26.6％,明显高于对照组(2.6％,x2 =5.455,P=0.020)和C9组(3.1％,x2=6.279,P=0.012).HEK293细胞对照组、C9组和Cri组的凋亡率分别为7.4％、7.6％、7.9％,Cri组与对照组和C9组比较,差异均无统计学意义(2=0.032,P=0.858;x2 =0.034,P=0.853).转染72 h后,SiHa细胞Cri组增殖抑制率为29.4％,明显高于对照组(15.0％,x2=22.481,P=0.000)和C9组(18.0％,x2=24.879,P=0.000).Cri组HEK293细胞在72 h的增殖抑制率为3.2％,与C9组(2.2％,x2=2.857,P=0.091)和对照组(2.3％,x2=3.438,P=0.064)比较差异均无统计学意义.转染48 h后,与对照组相比,SiHa细胞Cri组E7蛋白表达明显下调,pRb蛋白表达明显上升,而C9组E7蛋白和pRb蛋白含量没有明显变化.结论 靶向HPV16-E7的CRISPR可以特异性地促进HPV16阳性的SiHa细胞凋亡、抑制细胞增殖.其机制可能是通过特异性地作用于HPV16-E7基因使其双链DNA断裂、功能破坏,同时上调抑癌蛋白pRb表达.
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HPV16E6和E7基因序列多态性与宫颈癌临床病理特征相关性
目的 探讨宫颈癌人乳头瘤病毒16型(HPV16)E6和E7转化基因序列多态性,及其与宫颈癌临床病理特征的相关性.方法 从77例宫颈癌组织中筛选出51例HPV16阳性标本,扩增E6及E7基因,PCR产物进行序列测定.应用DNAStar生物软件进行核苷酸和氨基酸序列的分析.结果 宫颈癌组织中HPV16 E6共测得6个突变位点,均为错义突变;常见的突变位点为T178G/A(D29E),突变频率为56.00%,T178G/A突变在不同分化程度、不同分期、不同肿瘤大小及有无淋巴结转移组的分布频率差异无显著性(P＞0.05).宫颈癌组织中HPV16 E7共测得4个突变位点,2个为错义突变;常见的突变位点为A647G(N29S),突变频率为68.09%,A647G在中分化及低分化组的突变频率分别为56.67%、88.24%,两组间突变频率差异有显著性(x2=4.98,P＜0.05);A647G在不同分期、不同肿瘤大小、有无淋巴结转移组的分布频率差异无显著性(P＞0.05).结论 青岛地区HPV16 E6基因T178G/A突变与宫颈癌的发生发展无关,HPV16 E7基因A647G突变与宫颈癌的分化程度呈负相关,可以作为评估宫颈癌恶性程度的指标.
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植酸酮对宫颈癌细胞株中 HPV16／18 E6／E7 mRNA 及蛋白表达的影响
目的：观察植酸酮对宫颈癌细胞株中HPV16／18 E6／E7 mRNA及蛋白表达的影响。方法体外培养Caski细胞株（含HPV16）与Hela细胞株（含HPV18），将所有细胞分成实验1、2、3、4组和对照组，每组均包含Caski细胞和Hela细胞。实验1、2、3、4组分别加入含58．6、117、586、5860 mg／L植酸酮的培养液，对照组加入不含植酸酮的培养液。各组培养72 h后，采用real-time PCR法分别检测HPV16／18 E6／E7 mRNA，采用Western blotting法检测E6／E7蛋白。结果实验1、2、3、4组同一型别细胞中E6／E7 mRNA及蛋白相对表达量低于对照组，且实验1、2、3、4组E6／E7 mRNA及蛋白相对表达量依次降低（P均＜0．05）。各实验组内，Caski细胞中E6／E7 mRNA相对表达量低于Hela细胞（P均＜0．05）。各实验组内同一型别细胞中，E6 mRNA相对表达量低于E7 mRNA（P均＜0．05）。结论植酸酮可下调人宫颈癌细胞株中HPV16／18 E6／E7 mRNA及蛋白表达，且作用呈剂量依赖性；植酸酮对HPV16 E6／E7 mRNA的抑制作用强于HPV18 E6／E7 mRNA，并可能以抑制E6 mRNA表达为主导。
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食管癌Eca109细胞的HPV16-E6基因转染条件优化
目的：确定HPV16-E6基因转染食管癌Eca109细胞的佳转染条件。方法取体外培养的食管癌Eca109细胞，用中心复合试验设计分组，转染条件控制因素包括DNA用量、Lip2000／DNA和饥饿时间，DNA用量分0．65、1．00、1．50、2．00、2．35μg共5档，Lip2000／DNA分0．65、1．00、1．50、2．00、2．35μL／μg共5档，饥饿时间分0、3、7．5、12、15 h共5档，共设20个组。转染24 h后，倒置显微镜下观察各组荧光情况并拍照，用图像处理软件计算细胞转染效率；用CCK-8法测算各组细胞相对存活率。用响应曲面法绘制有交互影响的因素对细胞转染效率和相对存活率影响的响应曲面，以目的基因细胞数（转染效率×细胞存活率）大化为原则，确定佳转染条件。在佳转染条件下用HPV16-E6基因转染食管癌Eca109细胞，检测细胞转染效率和相对存活率。结果随着饥饿时间延长，细胞转染效率和细胞相对存活率呈下降趋势。依据饥饿0h的转染效率、细胞存活率响应曲面图，得出佳转染条件为（24孔培养板）：DNA用量1．35μg、Lip2000／DNA1．12μL／μg（换算成Lip2000用量为1．51μL）、细胞饥饿时间0 h；转染效率预测值可达38．68％，细胞相对存活率预测值为85．09％。在佳转染条件下用相同方法转染，实际转染效率为39．79％，与预测值的相对误差为2．87％。结论 HPV16-E6基因转染Eca109细胞的佳转染条件（24孔板）为：每孔DNA用量1．35μg，脂质体Lip2000用量1．51μL，不对细胞进行饥饿处理。
