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酿酒酵母胞壁多糖研究概述
随着糖生物学的深入研究,发现多糖具有许多特殊的生物学功能,参与生物细胞的多种生命调节,可激活免疫细胞,调节机体免疫力,具抗菌消炎、抗病毒、抗肿瘤等功能[1].酿酒酵母多糖是多糖的重要来源之一,同样具有这些生物学功能.酿酒酵母多糖可从酿酒发酵液中提取,但更多的是从酵母细胞壁获得.我国是酿酒大国,其发酵液及其酵母壁原料多,一般用作饲料或废弃[2].用酿酒后的废酵母为原料生产酵母多糖,产量大、周期短、生产条件不受季节及地理因素的影响、且产品稳定、基本无副作用,产品纯度较高,因而引起医药工作者的普遍关注.本文通过查阅文献,对酿酒酵母胞壁多糖的提取及应用研究进行综述以供同仁参考.
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重组全酿酒酵母HPV16-E7疫苗的构建及免疫原性初步研究
目的 构建人乳头状瘤病毒16型(HPV16)E7重组全酿酒酵母疫苗.初步评价疫苗的免疫应答效应.方法 将HPV16 E7 cDNA亚克隆入酵母表达载体pYES2/NT,重组质粒转化酿酒酵母,经诱导表达、热灭活制备全酵母HPV16-E7疫苗.疫苗免疫C57BL/6小鼠,ELISA检测其诱导的抗体和细胞因子表达水平.结果 重组全酵母疫苗能够有效地表达HPV16-E7蛋白;疫苗小鼠免疫,能够诱导出特异性抗HPV16-E7抗体,并促进Th1型细胞因子的表达.结论 研究结果 为进一步进行疫苗抗肿瘤免疫研究,提供了实验基础.
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人瘦素基因的克隆及在酿酒酵母中的表达和生物信息学分析
目的 构建人瘦素基因和蛋白转导肽Tat基因的融合表达载体,转入酿酒酵母表达系统进行诱导表达,并对融合瘦素蛋白进行生物信息学分析.方法 脂肪组织中提取总RNA,逆转录为cDNA,以此cDNA为模板扩增瘦素基因.构建重组质粒pYES2-Tat-leptin,转入酿酒酵母表达菌株INVSc1诱导表达Tat-leptin融合蛋白,利用相关在线软件对融合瘦素蛋白相关的生物学功能进行分析.结果 经SDS-PAGE电泳和Western blotting 鉴定,酿酒酵母成功表达融合蛋白Tat-leptin.经生物信息学分析后获得了融合瘦素蛋白的相关生物学特性.结论 Tat-leptin融合蛋白在酿酒酵母中成功表达,并对融合瘦素蛋白的生物学特征进行了预测,为消化道基因治疗肥胖的研究奠定了基础.
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融合基因Tat-HPV16L1的克隆及其在酿酒酵母中的表达
目的 构建人乳头瘤病毒16型L1基因和蛋白转导肽的Tat基因的融合表达载体,导人酿酒酵母表达系统进行诱导表达,为口服基因疫苗的制备打下基础.方法 以pBR322-HPV16质粒为模板扩增L1基因,与酿酒酵母表达载体pYES2连接.重组质粒再与自行设计的蛋白转导功能片段Tat连接,经测序鉴定后转入酿酒酵母表达菌株INVSc1诱导表达Tat-HPV16L1融合蛋白.结果 融合基因Tat-HPV16L1测序结果与预期完全符合,经过半乳糖诱导表达后进行SDS-PAGE电泳和Western blotting分析.结果 表明诱导表达成功.结论 成功构建和表达了融合表达载体pYES2-Tat-HPV16L1,为制备以酿酒酵母为运送载体的口服人乳头瘤病毒疫苗打下基础.
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汉逊酵母与酿酒酵母乙肝疫苗对阻断HBV母婴传播的免疫效果比较
目的 客观评价两种基因重组酵母乙肝疫苗联合乙型肝炎免疫球蛋白(HBIG)在HBV母婴传播中的免疫效果.方法 对在我院分娩的产妇,收集资料完整的HBsAg、HBeAg单、双阳性产妇正常分娩的健康状况良好的新生儿176例,随机分成2组,第1组接种汉逊酵母(大连疫苗)85例,第2组接种酿酒酵母(康泰疫苗)91例,两组同时联用乙型肝炎免疫球蛋白(HBIG)100 IU.两组均采用0、1、6月龄免疫程序,全程接种三针,疫苗剂量每次10μg.全程免疫后1个月和6个月检测抗-HBs和抗体几何平均滴度(CMT).结果 汉逊酵母乙肝疫苗和酿酒酵母乙肝疫苗全程免疫后1个月和6个月,抗-HBs阳转率(≥10 mIU/ml)分别为91.76%、88.06%和90.11%、85.71%,抗体几何平均滴度(GMT)分别为337.79 mIU/ml、313.82 mIU/ml和312.75 mIU/ml、281.15 mIU/ml,HBsAg阳性率分别为2.35%和3%,阻断保护率分别为97.39%和96.33%,从两组数据比较结果来看,抗-HBs阳转率、抗体几何平均滴度(GMT)、HBsAg阳性率和阻断保护率,统计学检验均无显著性差异.结论 汉逊酵母与酿酒酵母乙肝疫苗对阻断HBV母婴传播的近期免疫效果均较好,酿酒酵母疫苗的免疫效果得到了普遍公认,汉逊酵母乙肝疫苗在阻断HBV母婴传播的免疫效果比较的报道比较少,远期安全性和免疫效果的持久性比较,仍需作进一步跟踪观察.
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非诺贝特对酿酒酵母基因表达谱影响的研究
目的：探讨非诺贝特对酿酒酵母基因表达谱的影响，在基因表达水平上分析其作用机理。方法：采用非诺贝特（100μg/mL）处理酿酒酵母90min后，抽提细胞RNA进行反转录荧光标记cRNA，与基因表达谱芯片进行杂交，用激光扫描仪检测杂交信号，并用相应软件进行分析。结果：与正常对照组相比，非诺贝特导致19个已知的基因表达明显上升（诱导倍数>1.5），同时导致14个已知的基因表达明显下降（抑制倍数>1.5）；另外，非诺贝特显著诱导了α-亚麻酸、脂肪酸代谢和降解信号通路，抑制了丙酮酸和碳代谢、糖酵解和糖异生、二羧酸代谢等信号通路（P<0.05）。结论：非诺贝特可以明显调节脂肪酸、糖和尿酸代谢信号通路。
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一种酿酒酵母中表达梅毒螺旋体膜抗原基因的新方法
以梅毒螺旋体Nichols菌株基因组DNA为模板,通过PCR扩增梅毒螺旋体47kDa的膜抗原基因,克隆进酿酒酵母表达载体pPICZ B,构建重组表达载体pTP47,转化酵母菌株,乳糖诱导表达.首次提出一种在酿酒酵母中表达出梅毒螺旋体膜抗原的方法.
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HIV-1外膜蛋白gp120在酿酒酵母中的表达
将从HIV-1型标准株的基因序列中扩增出的gp120分子短片段基因(417bp)克隆入真核表达载体pPICZαA与pPICZB中,以电穿孔法转化酿酒酵母CYC3.经乳糖诱导表达后,gp120短片段多肽在CYC3中少量表达,在诱导表达24小时重组蛋白表达量及抗原性达到高,表达产物被降解,具有良好的抗原特异性.
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Agilent 2100 Bioanalyzer在基因差异表达研究中的应用
目的观察Agilent 2100 Bioanalyzer芯片分析系统(以下简称Bioanalyzer)在基因差异表达研究中的应用.方法应用限制性显示技术分别从正常和热休克处理后的酿酒酵母细胞中分离出cDNA片段,然后再用Bioanalyzer和传统的琼脂糖凝胶电泳技术对RD-PCR产物进行检测分析.结果Bioanalyzer能更快速、敏感地分离和显示差异表达的基因片段,并且通过对差异片段进行定量比较,发现了数个表达有明显差异的基因片段.结论Bioanalyzer在基因差异表达研究中具有重要的应用价值.
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酵母MT2基因菌株构建及其对复制性寿命的影响
目的 研究蛋白质-O-甘露糖转移酶-2(PMT2)基因对酿酒酵母复制性寿命的影响.方法 依据基因同源重组原理,构建PMT2基因缺失(pmt2)或基因过表达(PMT2-ox)酵母菌株;实时定量PCR验证菌株中PMT2基因转录水平;显微镜下分离和计数酵母子细胞数目,检测酵母细胞的复制性寿命.结果 成功构建PMT2基因缺失或过表达酵母菌株,实时定量PCR证明PMT2 mRNA 在pmt2菌株中无表达,在PMT2-ox菌株中表达上调.与野生型酵母细胞的平均寿命(约23代)比较,pmt2菌株的寿命为(25.2±8.9)代,PMT2-ox菌株的寿命为(24.1±7.3)代,寿命无明显延长(P＞0.05).结论 酿酒酵母PMT2基因不参与复制性寿命的调控.
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人血管抑素cDNA在酿酒酵母中的表达和分泌
目的:在酿酒酵母中表达和分泌人血管抑素.方法:应用DNA重组技术构建重组质粒;质粒DNA转化酵母用醋酸锂法;以纤溶酶原抗血清为第一抗体,采用ELISA方法检测表达产物.结果:将MFα1信号肽和人血管抑素融合基因序列插入酵母表达载体pMA91的Bg1Ⅱ位点,构建了重组表达质粒pMAA2,转化酿酒酵母GRF18后获得工程菌GRF18(pMAA2),其培养上清液ELISA分析阳性.结论:人血管抑素在GRF18(pMAA2)中得到表达,产物分泌至细胞外,能够与纤溶酶原抗血清发生特异的免疫反应.
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人生长激素的酿酒酵母表达质粒构建的新方法
目的:利用ECHO克隆系统建立一种更加快速、方便、通用的DNA重组技术.方法:用常规重组法构建出ECHO系统中的携带外源基因HGH的供载体,再利用ECHO系统快速构建人生长激素的酿酒酵母表达载体,使HGH能在酿酒酵母启动子GAL的调控下进行转录.结果:基因测序表明,在所构建的融合质粒载体上确实含有HGH的基因序列.结论:本方法为研究HGH的消化道基因治疗打下基础.
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肾癌G250/MN/CAIX抗原基因在酿酒酵母中的诱导表达及意义
[目的]观察G250抗原基因编码区cDNA全长基因片段在酿酒酵母中诱导表达情况,并初步探讨其作为肿瘤治疗中的意义.[方法]应用基因重组技术将人G250 cDNA序列克隆入酿酒酵母穿梭诱导表达载体pYES2/NT C,构建重组酵母真核表达质粒pYES2/NT C-G250并转化酿酒酵母菌株INVSc1,筛选阳性克隆转化子,经半乳糖诱导表达后进行菌体全蛋白的Western blot检测.[结果]成功构建pYES2/NT C-G250重组酿酒酵母诱导表达质粒,证实其能够在酿酒酵母中诱导表达,表达量随诱导时间而变化,8～12 h达高峰.[结论]人G250基因片段能够在酿酒酵母中表达,为进一步探讨基因重组酿酒酵母G250疫苗抗肿瘤效应及其安全性打下基础.
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TAT-HBsAg融合基因在酿酒酵母中的同源重组与表达
[目的]克隆HBsAg和TAT-HBsAg融合基因,在酿酒酵母中同源重组表达.[方法]以HBV基因组为模板PCR扩增HBsAg和TAT-HBsAg融合基因;从酿酒酵母文库质粒pHSS6-mTn-3xHA/LacZ中筛选出可在酿酒酵母中进行同源重组且具有强启动子的质粒pHL;将质粒pHL与TAT-HBsAg融合基因酶切后连接,转化酵母进行同源重组表达;ELISA鉴定蛋白的表达.[结果]酵母中表达了HBsAg蛋白和TAT-HBsAg融合蛋白.[结论]TAT-HBsAg融合基因可以通过同源重组,在酵母细胞中进行产物表达.
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前列腺特异性膜抗原基因片段在酿酒酵母中的诱导表达及意义
[目的]分析前列腺特异性膜抗原(PSMA)基因片段在酿酒酵母中的诱导表达情况,以便进一步探讨重组人PSMA的免疫活性并完成抗前列腺癌PSMA蛋白疫苗的制备.[方法]应用基因重组技术将人PSMAcDNA序列克隆入酿酒酵母穿梭诱导表达载体pYES2/NT,构建重组酵母真核表达质粒pYES2/NT-PSMA,转化酿酒酵母菌株INVSc1,尿嘧啶筛选出阳性克隆转化子,经半乳糖诱导表达后进行菌体全蛋白的Western blot检测.[结果]成功构建了PSMA的酵母真核表达重组子pYES2/NT-PSMA,并在酿酒酵母INVSc1中得到有效表达,Western blot显示两个特异性的人重组PSMA全蛋白片段,相对分子质量分别为Mr=100×103及Mr=85×103.[结论]人PSMA基因片段能够在酿酒酵母中表达并进行翻译后糖基化修饰,为下一步进行抗前列腺癌PSMA疫苗的研制奠定了良好基础.
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Wilson病基因突变酵母分析系统的建立
[目的]建立一种能够对 Wilson病( WD)基因突变进行分析的方法,为众多的 WD基因突变进行致病性和致病程度的分析.[方法]本试验应用的酿酒酵母是 YPH252,及其 CCC2基因突变型 ccc2酵母细胞.应用酶切方法构建了寡拷贝酵母表达质粒 pMA92.将 ATP7B亚克隆到酵母表达质粒 pMA92上,进行 ccc2酵母的转化和筛选, Western blot分析转化后酵母 ATP7B的表达情况,在铜、铁、色氨酸缺陷型的酵母 SD培养基上培养转化的细胞,进行酵母生长曲线的分析,并进行 Fet3p氧化酶活性的测定.[结果]在 ccc2酵母细胞内表达人的 ATP7B可以弥补 ccc2的运铜功能,使 ccc2酵母细胞在铜、铁及亮氨酸缺陷型培养基上生长良好.[结论] ccc2酵母细胞是研究 ATP7B功能的一种良好的细胞模型,单拷贝 ATP7B的表达就可以代偿 ATP7B的功能缺陷,从而建立了可以对 ATP7B进行分析的酵母分析系统.
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人生长激素的酵母/哺乳动物穿梭载体的构建
目的酿酒酵母已被证实可作为载体应用于口服基因治疗及免疫中.为研究人生长激素(HGH)以酿酒酵母作为运送载体的口服基因药物,需要构建一种能够在酵母中复制而在哺乳动物细胞表达的HGH穿梭载体.方法利用ECHO克隆系统先构建出HGH的哺乳动物表达载体,使HGH处于CMV启动子的调控下;然后设计引物扩增CMV-HGH片段,连接到酿酒酵母表达载体pESC-URA中,构建HGH的酵母/哺乳动物穿梭载体.结果经EcoRI单酶切、EcoRI/SpeI双酶切、菌落PCR以及序列测定鉴定,确认所构建的确为酵母/哺乳动物穿梭载体pESC-CMV-HGH.结论成功构建的穿梭载体可在酿酒酵母中复制,在哺乳动物中受CMV启动子的调控进行表达,为HGH的口服基因药物研制打下了基础.
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以GFP为报告基因的重组酿酒酵母消化道转基因研究
目的以GFP为报告基因,研究重组酿酒酵母消化道途径转基因的可能.方法以6～8周龄Balb/c小鼠为实验对象,根据管饲材料不同对动物进行分组:第1组为空白对照组;第2组管饲酿酒酵母INVScl;第3组管饲携带酿酒酵母-哺乳动物细胞穿梭载体pYES-CMV-GFP的重组酿酒酵母;每次每只Balb/c小鼠灌胃0.3lml(108个)重组酿酒酵母悬浮液,2 d 1次,持续4周后采用免疫组织化学染色法检测小鼠小肠、肝脏、脾脏组织中GFP基因的表达.结果在第3组小鼠小肠、肝和脾组织中,有免疫组化呈阳性的检测结果,其中6只小鼠中的4只小肠组织免疫组化结果呈阳性,肝脏、脾脏分别有1只免疫组化结果呈阳性,而阴性对照组中小鼠的各组织结果均呈阴性.结论以酿酒酵母作为基因载体实现消化道途径转基因存在可能,为进一步研究酿酒酵母在基因治疗药物载体上的应用提供了实验基础.
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模式生物体的人类疾病模型
人类基因组计划的实施为人类遗传性疾病的研究提供了理论基础.在人类基因数据库中,已有数千个确定的人类基因与已知的人类疾病有关[1].遗传学专家将在近几年内,对大量单基因病的致病基因进行定位,并通过经典方法,对多基因缺陷而引起的多基因病进行深入的研究.通常所采用的快速基因疾病诊断方法,多集中于单基因疾病的诊断,通过对那些进化与人类相隔较远,却又与人类有一定相关性的简单模式生物体(如酿酒酵母、果蝇、线虫类、斑马鱼等)进行分析,将对人类疾病相关基因功能的研究起到较大的作用.
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瑞舒伐他汀对酿酒酵母基因表达谱影响的研究
目的 研究瑞舒伐他汀对酿酒酵母基因表达谱的影响,在基因表达水平上分析其作用机理.方法 采用瑞舒伐他汀(100 μg/mL)处理酿酒酵母90 min后,抽提细胞RNA进行反转录荧光标记cRNA,与基因表达谱芯片进行杂交,用激光扫描仪检测杂交信号,并用相应软件分析.结果 与正常对照组相比,瑞舒伐他汀导致50个已知的基因表达明显上升(诱导倍数＞1.5),同时导致34个已知的基因表达明显下降(抑制倍数＞1.5).另外,瑞舒伐他汀显著诱导了固醇合成信号通路和MAPK信号通路,抑制了氧化磷酸化信号通路(P＜0.05).结论 瑞舒伐他汀可以明显调节固醇合成,炎症和氧化应激等信号通路.
