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用分泌型萤光素酶报告系统比较TTR启动子与CMV启动子的体内外表达特性
Gluc(Gaussia Luciferase)是一种高灵敏度分泌型萤光素酶.本研究利用Gluc的易分泌、高灵敏性和检测方法简单快速的特点,初步比较了TTR启动子(P_(TTR))与CMV启动子(P_(CMV))的体内外表达特性.首先构建了两种启动子-报告基因表达质粒pAAV2-neo-TTR-Gluc和pAAV2-neo-CMV-Gluc.用脂质体转染法将它们分别转染至两株肝细胞源的细胞株Huh7与HepG2以及两株非肝细胞源细胞株HEK293与HeLaS3.在转染后不同时间点取细胞培养上清液检测Gluc的表达.此外采用水动力注射法,将这两种质粒分别以注射剂量0.1μg、1μg和10μg/只经尾静脉注射至BALB/c小鼠体内,注射后2h开始在不同时间点上经尾静脉采集全血(2.5μl/次)并测定血液中的Gluc水平.细胞实验结果显示,P_(CMV)介导的Gluc表达都明显高于P_(TTR);然而,在HEK293和HeLaS3细胞中P_(CMV)比P_(TTR)的表达水平高50～300倍,而在Huh7和HepG2中仅高10倍以内,提示P_(TTR)具有相对的肝细胞特异性.在小鼠实验中,P_(CMV)介导的Gluc表达在各剂量组中也明显高于P_(TTR),然而它们表达水平变化特征明显不同:P_(CMV)介导的Gluc表达在质粒注射后约10h达到大值,此后迅速下降;而P_(TTR)介导的Gluc表达在质粒注射后约48h达到峰值,随后缓慢下降.上述实验结果提示,P_(TTR)虽然在表达强度方面不及P_(CMV),但其介导的表达水平维持长时间,下降较缓慢,比较适于目的基因在肝脏内的较长时间表达.
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树鼩水动力转染方法的建立及在HBV模型探索中的应用
目的 建立一种水动力注射将外源基因导入树鼩肝脏的方法,并用此方法建立HBV树鼩模型.方法 用萤火虫荧光素酶(firefly luciferase,Fluc)和β-半乳糖苷酶(β-galactosidase,β-Gal)作为报告基因,通过树鼩大隐静脉将报告基因用水动力注射方法导入树鼩肝脏,活体成像和β-Gal染色观察水动力转染效果.将pHBV1.2质粒用水动力注射方法转入树鼩肝脏,检测树鼩血清中ALT、实时荧光定量检测血清中HBV DNA,ELISA 检测血清中HBsAg、HBsAb.结果 通过大隐静脉水动力注射,报告基因能够在肝脏特异性表达,转染HBV1.2质粒后树鼩血清中能够检测到相关阳性指标.结论 大隐静脉水动力注射法能够作为树鼩肝脏外源基因导入的一种方法,并用此方法初步探索了树鼩的HBV模型.
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乙型肝炎病毒-三磷酸-小干扰核糖核酸抑制小鼠乙型肝炎病毒复制并激活β干扰素的表达
目的：观察 HBV-三磷酸（3p）-小干扰 RNA（siRNA）激活受试小鼠Ⅰ型干扰素抗病毒天然免疫反应以及抑制 HBV 基因组复制的双重作用。方法针对 HBV 基因组 S/P mRNA 设计并通过体外转录法制备带有5′-3p-修饰的 HBV-3p-siRNA；以未经修饰的 HBV-siRNA 和阴性对照（NC）-siRNA 作为对照；利用尾静脉水动力注射法建立 HBV 感染小鼠模型。将40只小鼠分为4组，每组10只，模型组：仅注射 pGL3．0-HBV 1．2拷贝质粒；阴性对照组：腹腔注射 NC-siRNA；HBV-siRNA 组：腹腔注射 HBV-siRNA；HBV-3p-siRNA 组：腹腔注射 HBV-3p-siRNA。ELISA 法检测小鼠血清中HBsAg 的表达和β干扰素的分泌量；荧光定量 PCR 检测小鼠血清 HBV DNA。采用 LSD 或 Dunnett T3统计方法进行 One way-ANOVA 统计学分析。结果小鼠血清中β干扰素水平模型组为（12．37±5．32）pg/mL，阴性对照组为（22．61±6．29）pg/mL，HBV-siRNA 组为（26．40±5．39）pg/mL，HBV-3p-siRNA 组为（68．37±21．00）pg/mL，HBV-siRNA 组和 HBV-3p-siRNA 组与模型组相比，差异有统计学意义（F 值分别为23．988、46．523，均 P ＜0．01）。小鼠血清中 HBsAg 水平模型组为（2864．86±907．11）ng/mL，阴性对照组为（2198．86±456．89）ng/mL，HBV-siRNA 组为（1049．71±396．28）ng/mL， HBV-3p-siRNA 组为（640．86±383．08）ng/mL，HBV-siRNA 组和 HBV-3p-siRNA 组与模型组相比，差异有统计学意义（F 值分别为23．537、39．144，P 值分别为0．025、0．010）。小鼠血清中 HBV DNA 的水平模型组为（2．54×104±1．46×104）拷贝/mL，阴性对照组为（2．22×104±2．62×103）拷贝/mL， HBV-siRNA组为（3．59×103±2．88×103）拷贝/mL，HBV-3p-siRNA 组为（2．65×103±1．46×103）拷贝/mL，HBV-siRNA 组和 HBV-3p-siRNA 组与模型组相比，差异均有统计学意义（F 值分别为15．013、16．741，均 P ＜0．05）。HBV-3p-siRNA、HBV-siRNA，以及 NC-siRNA 对 HBV 感染小鼠的体质量无明显影响。结论HBV-3p-siRNA可以通过 RNA 干扰机制特异性抑制 HBV 复制，提高机体天然免疫功能，是一种新型抗 HBV 核酸分子。
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体内转导HBV cccDNA法建立HBV慢性感染的小鼠模型
目的 通过体内转导乙型肝炎病毒(HBV) cccDNA,建立持续表达HBV抗原的小鼠乙型肝炎模型. 方法 取10只裸小鼠,将HBV cccDNA以3μg/只、2 μg/只、1μg/只分别注射实验组,同时以2ml等渗盐水注射空白组,分别于第1、3天,第1、2、3、4、5、6、8、10周进行尾静脉采血.用放射免疫法检测血清中乙型肝炎表面抗原(HBsAg)和乙型肝炎e抗原(HBeAg)浓度的变化;荧光定量PCR检测血清和肝组织中HBV DNA拷贝数;免疫组织化学法检测肝组织中HBV抗原特异性;苏木素-伊红(HE)染色观察肝组织病理变化.使用SPSS 17.0对数据间相关性进行线性相关分析. 结果 小鼠在注射cccDNA后,从第1天开始于血液中检测到HBsAg和HBeAg的表达,两者均于第1周内迅速升高达到高值,并持续至第10周;其中HBsAg的表达水平经历了两个先上升再下降的过程(第4周为较低水平,第8周为较高水平),而HBeAg的表达水平经历了三个先上升再下降的过程(第2周、第4周为较低水平,第3周、第6周为较高水平);荧光定量PCR结果表明,10周后肝组织中HBV DNA的拷贝数随着高、中、低剂量组而递减,每克肝组织中HBV DNA拷贝数[(1.14E+07)±(6.51E+06)、(9.81E+06)±(9.32E+06)、(3.72E+06)±(2.35E+ 06)]与注射的cccDNA浓度(1.5、1.0、0.5 μg/ml)呈正相关(皮尔森相关系数r=0.979).10周后血清中HBV DNA的拷贝数为中剂量组高,其次为高剂量组,同时,各组血清中的HBV DNA拷贝数较肝组织中的低;免疫组织化学结果显示,实验组裸小鼠肝组织中存在HBsAg和HBcAg的表达,HE染色结果显示肝组织脂肪样或空泡样变性严重,肝小叶组织结构不明显. 结论 本研究利用HBVcccDNA质粒体内转导裸小鼠,成功建立了HBV在肝组织稳定复制并持续表达HBV抗原的裸小鼠模型,为进一步研究HBVcccDNA慢性持续感染的机制和抗病毒治疗打下基础.
