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冬凌草抗菌活性成分研究
目的：研究冬凌草的抗菌活性成分。方法：利用纸片扩散法（K-B法）进行抗菌活性成分筛选；采用色谱法对活性部位进行分离，并运用波谱技术鉴定结构。结果：从冬凌草乙酸乙酯部位分离鉴定了6个化合物：冬凌草甲素（1）、迷迭香酸（2）、咖啡酸（3）、水杨酸（4）、阿魏酸（5）和香草酸（6）。冬凌草甲素对金黄色葡萄球菌（SA）、耐甲氧西林葡萄球菌（MRSA）、β-内酰胺酶阳性的金黄色葡萄球菌（ESBLs-SA）均有一定的抗菌活性，且抗菌活性强（MIC为3.125、6.25、6.25μg·disc-1），但仍弱于阳性对照小檗碱（MIC值均为0.156μg·disc-1）。阿魏酸对SA和MRSA有一定的抗菌活性（MIC为50和50μg·disc-1），水杨酸仅对SA有抗菌活性（MIC为50μg·disc-1）。结论：冬凌草甲素、阿魏酸和水杨酸是冬凌草的主要抗菌活性成分。
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冬凌草化学成分积累动态的研究
目的:分析冬凌草化学成分的积累动态.方法:采用中国药典(2005年版)的方法进行水溶性浸出物、醚溶性浸出物的测定;用高效液相色谱法测定冬凌草中冬凌草甲素、迷迭香酸的含量.结果:冬凌草中水溶性浸出物、醚溶性浸出物、冬凌草甲素、迷迭香酸的含量在不同生长时期有明显的变化规律.结论:冬凌草中化学成分动态积累的变化规律,将为研究冬凌草生物特性的形成及冬凌草的规范化种植提供科学依据.
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稀土元素对冬凌草愈伤组织生长及冬凌草甲素、乙素含量的影响
目的:探讨稀土元素镧、铈对冬凌草愈伤组织生长及冬凌草甲素、乙素含量的影响.方法:冬凌草均匀愈伤组织在添加不同浓度La3或Ce3的培养基中培养,通过质量法测定愈伤组织鲜质量、绘制生长曲线,HPLC测定甲素、乙素含量.结果:CeCl3·7H2O浓度为1μmol·L-1时,愈伤生物量高,是空白条件下的2.4倍.空白及对照条件下甲素含量均为0；空白条件下乙素含量低为0.11％,随着Ce3+浓度升高而升高,当浓度为10 μmol· L-1时高达0.58％；乙素随着La3+浓度升高而降低,当浓度为0.1 μmol· L-1时含量高达0.44％.结论:0～ 10 μmol·L-1的La3+及Ce3+均有利于冬凌草愈伤生物量的积累及乙素的合成,对甲素的合成无影响,将CeCl3 ·7H2O浓度10 μmol· L-1作为佳条件选择.
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HPLC测定冬凌草饮片中冬凌草甲素含量
目的:建立冬凌草饮片的含量测定方法,并对市售饮片进行含量分析,以考察其质量.方法:色谱柱:Agilent ZORBAX Eclispse XDB-C18柱(4.6 mm×150 mm,5 μm),流动相:甲醇:水(50:50),检测波长:240 nm.结果:冬凌草甲素在0.41～1.02μg范围内呈良好线性关系,r=0.999 8,加样回收率平均为99.2%(n=9,RSD=1.5%).结论:该法灵敏度高、操作简便、结果准确.可用于冬凌草饮片的含量测定.
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冬凌草对血浆复钙作用的凝血活性成分
目的:从冬凌草中寻找具有血浆复钙作用的活性成分.方法:对冬凌草乙酸乙酯部位和甲醇部位采用各种柱色谱进行分离纯化,以对体外血浆复钙时间的影响为活性指标,对冬凌草中活性成分进行筛选.结果:从乙酸乙酯部位和甲醇部位共分离鉴定了6个化合物,其中,与维生素K1组相比,冬凌草甲素(1)和迷迭香酸(2)对血浆复钙时间的影响无显著性差异;与空白组相比,咖啡酸(3)对血浆复钙时间的影响无显著性差异;水杨酸(4)(214.77±5.8)s和阿魏酸(5) (233.43±6.88)s对血浆复钙时间小于空白组(252.23±2.6)s,大于维生素K1组(158.2±2.33)s;香草酸(6)(286.2±4.53)s对血浆复钙时间大于空白组,小于灯盏花素组(309.87 ±2.34)s.结论:冬凌草甲素、迷迭香酸、水杨酸和阿魏酸具有促凝血作用;香草酸具有抗凝血作用.
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河南产冬凌草的质量评价
目的:对产于河南济源地区不同品种冬凌草资源进行质量评价.方法:以冬凌草甲素为对照,按照《中国药典》(2010年版),采用高效液相色谱法,Agilent TC-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5μm),流动相甲醇-水(55∶45),检测波长239nm,柱温25℃,流速1 mL· min-1,对收集到的34个不同品种冬凌草中冬凌草甲素的含量进行测定.回归方程为Y=1006X+9.046(r =0.9999),线性范围在0.488 ～4.88 μg与峰面积线性关系良好,平均回收率为98.80％,RSD 2.17％.结果:不同品种的冬凌草中冬凌草甲素的含量有显著的差异,其中低含量是0.63％,高含量是1.98％,均符合药典标准.结论:冬凌草甲素是冬凌草的主要有效成分,可以作为冬凌草质量评价的一个重要指标.本方法简单易行,重复性好且分离度高,为评价冬凌草的质量提供科学依据.
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冬凌草的质量控制研究
目的:采用HPLC法建立冬凌草的质量控制方法.方法:Shim-pack CLC-ODS(150mm×4.6mm)为色谱柱,甲醇0.5%汉磷酸采用梯度洗脱,检测波长280nm,流速0.8mL/min,柱温25℃.结果:精密度、重复性和稳定性试验中各共有峰相对保留时间的RSD均小于3%,符合有关规定.结论:本方法可以作为控制冬凌草内在质量的方法之一.
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冬凌草IrCYP71基因的克隆和功能
目的:克隆冬凌草二萜类化合物生物合成途径下游关键酶基因IrCYP71,进行序列特征分析,对此基因编码的蛋白进行原核表达分析以及亚细胞定位,并对蛋白在宿主细胞表达的条件进行了优化.方法:根据转录组测序所得的IrCYP71基因片段,克隆出全长cDNA序列;构建pET28a(+)-IrCYP71重组质粒,转化到Rosetta感受态细胞,小量表达和大量表达蛋白并鉴定,进行包涵体蛋白的纯化与复性,再对复性蛋白纯化鉴定分析.基于gateway克隆技术构建出PCR8/GW/TOPO-IrCYP71载体之后与改造Pearleygate104载体重组,之后与农杆菌GV3101重组,转入烟草中瞬时表达,从而进行蛋白亚细胞定位.结果:克隆得到的IrCYP71基因全长cDNA为1 593 bp,编码530个氨基酸,并在GenBank注册(登录号MG800628).经大肠埃希菌表达系统表达的重组蛋白相对分子质量正确,在62 kDa左右,纯化后的重组蛋白总量有1 mg,蛋白纯度为85％.此蛋白亚细胞定位在细胞核.结论:对冬凌草IrCYP71基因进行了初步验证,并对基因表达的蛋白进行原核表达和亚细胞定位,使该基因在冬凌草二萜成分的生物合成过程中的作用得到了进一步的阐述.
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不同产地和来源冬凌草药材的质量评价
目的:评价不同产地冬凌草药材的质量,为冬凌草的利用和开发提供科学依据.方法:采用高效液相色谱法对不同产地冬凌草中冬凌草甲素、冬凌草乙素、迷迭香酸的含量进行测定,按照《中国药典》2010年版附录中测定法对冬凌草中水溶性浸出物和醚溶性浸出物进行测定；综合分析评价各冬凌草样品间的差异.结果:不同产地、不同变异类型冬凌草中各种成分的含量有明显差异.冬凌草甲素、冬凌草乙素、迷迭香酸是造成不同地区冬凌草质量差异的主要因素,相比较而言醚溶性漫出物对冬凌草质量差异的影响要大于水溶性浸出物；而冬凌草变异类型的质量差异主要是由冬凌草甲素和乙素的含量变化造成的.结论:不同产地和不同变异类型来源的冬凌草在质量上有所不同,应用时应加以区别.
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离体条件下培养物中冬凌草甲素积累与其组织结构关系
目的:研究冬凌草甲素动态积累变化关键期培养物显微、超微结构的变化,探讨培养物组织结构与冬凌草甲素积累的相关性.方法:采用高效液相色谱法研究了离体培养过程中培养物内冬凌草甲素积累的动态变化规律.在此基础之上,采用石蜡切片、透射电镜方法研究了培养物组织结构与冬凌草甲素积累的关系.结果:离体培养过程中培养物中冬凌草甲素积累表现出有-无-有的规律性,随着叶片外植体的脱分化,培养物内叶绿体数目逐渐减少,冬凌草甲素的含量也随之逐渐降低,当冬凌草甲素再次积累时,培养物内叶绿体数目再次增多且出现了维管组织的分化.结论:冬凌草甲素积累合成与培养物叶绿体数目的多少及内部维管系统的分化有着紧密的联系.
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冬凌草1-脱氧木酮糖-5-磷酸还原异构酶(DXR)基因克隆与分析
目的:为研究冬凌草二萜类合成的相关基因,在冬凌草转录组信息数据的基础之上,以冬凌草无菌苗为研究材料,克隆冬凌草二萜类合成的关键酶1-脱氧木酮糖-5-磷酸还原异构酶(l-deoxy-D-lxyluloses-phosphatereduetoisomerase,DXR)基因.方法:采用逆转录PCR技术克隆冬凌草DXR基因,实时荧光定量PCR法分析其组织表达模式.结果:DXR cDNA基因全长1 500 bp,DXR基因开放阅读框为1 422 bp,编码473个氨基酸组成的蛋白质序列,理论相对分子质量为51.39 kDa,等电点为6.09,是一种亲水性蛋白.DXR在茎中表达量相对较高,在愈伤组织中表达量低.结论:研究结果为深入研究冬凌草DXR酶的活性和功能及为冬凌草二萜类化合物的生物合成机制、优良基因挖掘奠定基础.
关键词： 冬凌草 二萜 1-脱氧木酮糖-5-磷酸还原异构酶 -
冬凌草植株再生过程中冬凌草甲素的积累机制
目的:探讨冬凌草植株再生过程中培养物的生理特性与冬凌草甲素积累之间的机制.方法:采用紫外分光光度法、高效液相法测定不同时期培养物内叶绿素、可溶性糖、可溶性蛋白、丙酮酸、冬凌草甲素的含量.结果:培养物内叶绿素、丙酮酸、可溶性蛋白含量与冬凌草甲素含量呈正相关,相关系数分别为0.781,0.897,0.866;而可溶性糖含量与冬凌草甲素含量呈负相关,相关系数为-0.515.结论:冬凌草培养物内叶绿素、丙酮酸的含量、可溶性蛋白与冬凌草甲素积累有相互促进的关系,而可溶性糖变化主要与培养物细胞的生长、发育关系密切.
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冬凌草片治疗急性咽炎160例临床观察
目的 探讨冬凌草片治疗急性咽炎的临床效果,方法 按疗程用药服用冬凌草片(安阳路德药业公司生产)治疗期间不服其它药物.结果治疗组服用冬凌草片按疗程用药治愈率80%,对照组口服双黄连口服液,治愈率为52.5%.结论结果 表明冬凌草片治急性咽炎疗效显著,服用方便值得推广.
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HPLC测定冬凌草中迷迭香酸、冬凌草甲素和猫眼草黄素的含量
建立同时测定冬凌草药材中迷迭香酸、冬凌草甲素和猫眼草黄素含量的高效液相色谱方法.采用Ultimate C18色谱柱(4.6mm×250 mm,5μm)；流动相甲醇-0.1％甲酸水溶液,梯度洗脱；流速1.0mL·min-1；柱温30℃；检测波长338,242 nm.迷迭香酸、冬凌草甲素和猫眼草黄素的线性范围分别为0.222～2.78,0.227 ～2.84,0.00568～0.071 μg；平均加样回收率分别为102.9％(RSD 1.9％),99.6％ (RSD 1.1％),102.5％(RSD 0.94％).该方法简便、准确,重复性好,可用于冬凌草药材的质量控制.
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Pb2+胁迫对冬凌草种子萌发和幼苗生长的影响
以冬凌草种子为材料,研究铅(Pb2+)溶液(0,135,270,540,1080mg·L-1)对冬凌草种子萌发和幼苗生长的影响.结果表明:①低浓度Pb对冬凌草种子萌发无显著影响,Pb质量浓度135 mg·L-1条件下的种子发芽势高于对照,发芽速度快于对照,但差异均不显著;中高质量浓度Pb (270 ～1 080 mg·L-1)对种子萌发有显著的抑制效应,随着Pb浓度的升高,种子发芽率、发芽势和发芽指数呈递减趋势,均显著低于对照(P＜0.05),发芽率比对照低23.97％ ～ 55.37％.②低质量浓度Pb(135 mg·L-1)条件下,冬凌草幼苗生长活力指数低于对照,但差异不显著;中高质量浓度Pb (270 ～1 080 mg·L-1)对幼苗生长有显著抑制效应(P＜0.05),胚根长、胚芽长、生物量、生长活力指数均显著低于对照;胚芽和胚根生长受Pb胁迫,其中胚根生长受抑制程度大于胚芽,胚根长比对照低43.09％ ～ 100％.③冬凌草Pb富集系数为0.76 ～2.59,随Pb浓度增高而增大;Pb生物富集是抑制幼苗生长的主要原因.④经拟合模型预测分析,比对照发芽率和生物量鲜重降低10％的Pb临界质量浓度分别为195.18,101.65 mg· L-1.
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冬凌草煎液膀胱灌注结合高能聚焦超声热疗治疗膀胱癌31例
高能聚焦超声热疗(焦域温度可达70～100℃)是近年发展起来的一种肿瘤治疗新技术,具有无创、无毒、安全等优点,对盆腹腔恶性肿瘤有良好的疗效,但超声热疗临床用于膀胱癌的治疗,难以防止肿瘤复发和新病灶的发生.我院自2003年7月-2006年6月,采用高能聚焦超声热疗配合冬凌草煎液膀胱灌注治疗未转移或膀胱外浸润的膀胱癌患者31例,并与单纯高能聚焦超声热疗的30例作对照,现报告如下.
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冬凌草液热疗预防浅表性膀胱癌术后复发的非随机同期对照研究
目的比较中药冬凌草液热疗和多次丝裂霉素膀胱内灌注预防浅表性膀胱移行细胞癌术后复发的作用.方法采用前瞻性非随机同期对照试验,将123例患者分为两组,A组在术后1～2个月开始行冬凌草液热疗,每3个月1次,共1年;B组行丝裂霉素膀胱内多次灌注,术后2周开始,每周1次,共6次,然后每个月1次,共1年.观察术后复发率和无瘤间期及不良反应发生情况.结果随访10～45个月,平均(28.6±5.8)个月.A组复发率5.0%,B组复发率14.3%,两组复发率及Kaplan-Meier生存曲线比较,差异均有显著性(P＜0.05).治疗后发生膀胱炎、血尿、膀胱挛缩、尿道狭窄A组分别为28.3%、5.0%、1.7%、1.7%,B组分别为25.4%、4.8%、0%、0%,两组比较差异无显著性(P＞0.05).结论冬凌草液热疗对预防浅表性膀胱移行细胞癌术后复发的效果可靠.
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冬凌草单药及与化疗合用治疗食管癌205例
目的:观察冬凌草单药及与化疗合用治疗食管癌的临床疗效.方法:448例患者,均经病理细胞学和S线检查确诊为食管癌.其中早期癌76例,均采用冬凌草单药治疗.晚期癌372例,167例采用冬凌草单药治疗,205例采用冬凌草与化疗合用.结果:用冬凌草单药治疗早期食管癌患者3,5,10,13 a的生存率明显高于未治疗组(98.68%vs 51.52%,84.02% vs 28.62%.63.49% vs 11.45%,50.13% vs 8.59%;P＜0.001).对于晚期食管癌,冬凌草联合化疗应用,其总有效率明显高于以PYM(BLM)为基础的单一化疗(66.82% vs 42.85%,P＜0.01).冬凌草与化疗合用组与单一化疗对照组相比副作用基本相同.无明显差异(P＞0.05).结论:对于早期食管癌患者,冬凌草能控制疾病发展延长生存时间;对于晚期食管癌患者,冬凌草能增强化疗的作用.
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冬凌草中新二萜化合物Jaridonin激活共济失调毛细血管扩张突变蛋白激酶诱导胃癌细胞周期阻滞
目的：探讨冬凌草中新型二萜化合物Jaridonin对人胃癌细胞周期的影响及其分子机制。方法采用流式细胞术检测Jaridonin对MGC?803细胞共济失调毛细血管扩张突变（ ATM）蛋白的表达和细胞周期的影响，采用Western blot法检测细胞周期调控相关蛋白的表达情况。结果 Jaridonin对胃癌MGC?803细胞细胞周期具有阻滞作用，10、20μmol／L Jaridonin作用MGC?803细胞6 h，G2／M期细胞比例分别为（18．2±2．5）％和（27．3±3．2）％，与对照组[（10．8±2．2）％]比较，差异有统计学意义（P＜0．05）；作用12 h后，G2／M期细胞比例分别为（24．1±2．0）％和（39．7±5．2）％，与对照组[（12．0±1．5）％]比较，差异有统计学意义（P＜0．01）。 Jaridonin将MGC?803细胞阻滞在G2／M期，且呈浓度和时间依赖性。 Jaridonin作用MGC?803细胞后，ATM、Chk1和Chk2以及磷酸化的Cdc2和CDK2蛋白的表达上调，而非磷酸化的Cdc2和CDK2水平则下降。 ATM抑制剂KU?55933逆转了Jaridonin诱导相关蛋白的表达和G2／M期阻滞。结论 Jaridonin可显著诱导胃癌细胞G2／M期阻滞，其机制与ATM介导的Chk1和Chk2活化，以及Cdc2和CDK2磷酸化失活有关。
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冬凌草热疗预防膀胱肿瘤复发护理
冬凌草系唇形科香茶菜属植物,实验证明其二萜类成分具有抗肿瘤作用[1].冬凌草稳定性较强,加热至238℃时,其有效成分仍不破坏.
