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痘苗病毒主要核心蛋白水解的研究进展
痘苗病毒(vaccinia virus,VV)是痘病毒科正痘病毒属的dsDNA病毒,具有独特的形态及宿主细胞质复制位点[1].其病毒颗粒有4个结构组分:核心、侧体、外膜和包膜(只存在细胞外包膜病毒中)[2].该病毒的基因组大约185 ～ 200kb,编码200多种不同的病毒蛋白[3].VV在复制晚期(即病毒DNA合成后)发生了一系列复杂反应,用以形成成熟的病毒粒子[4].
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乙肝病毒表面抗原"a"决定簇病毒样颗粒的构建和鉴定
目的 构建一个以乙肝核心抗原为骨架的病毒样颗粒,乙肝表面抗原"a"决定簇呈现在该病毒样颗粒的表面.方法 乙肝adr血清型的HBsAg蛋白"a"抗原决定簇(aa139～148,CSKPTDGNCT)插入到HBcAg的第78位天冬氨酸和第79位脯氨酸之间,密码子优化之后基因合成,酶切后连接到表达载体上,在大肠埃希菌中进行表达,纯化后对蛋白进行电镜观察、ELISA检测抗原性、免疫兔后检测免疫原性.结果 构建得到预期的原核表达质粒,并在大肠埃希菌中表达,纯化后电镜观察为病毒样颗粒,ELISA检测证实具有良好的抗原性和免疫原性.结论 成功获得预期的带乙肝表面抗原"a"决定簇的病毒样颗粒,为其应用奠定基础.
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JY佐剂对HPV16和18型L1病毒样颗粒黏膜免疫效果的影响
目的 探讨JY佐剂对人乳头瘤病毒16和18型L1病毒样颗粒(HPV16 +18 L1 VLP)黏膜免疫效果的影响.方法 用含或不含JY佐剂的HPV16+ 18 L1 VLP分别经鼻腔和肌内注射免疫小鼠3次,检测血清IgG抗体、中和抗体和肺灌洗液sIgA抗体滴度与细胞免疫反应.结果 含JY佐剂的HPV16+ 18 L1 VLP鼻腔免疫组血清IgG抗体滴度明显高于不含佐剂组(P＜0.01),含或不含佐剂的VLP肌内注射组抗体滴度相同;含JY佐剂的HPV16+ 18 Ll VLP肌内注射免疫组血清中和抗体滴度高于不含佐剂组,仅在含有佐剂的VLP鼻腔免疫组检测到血清中和抗体;含JY佐剂的HPV16+ 18 L1 VLP鼻腔免疫组肺灌洗液sIgA抗体浓度明显高于不含佐剂组(P＜0.05);含JY佐剂的HPV16+ 18 L1 VLP鼻腔免疫和肌内注射组细胞斑点数均明显高于不含佐剂组(P ＜0.01,P＜0.05).结论 JY佐剂能增强HPV16+ 18 L1 VLP经鼻腔免疫后的小鼠的细胞、体液和黏膜免疫应答,但肌内注射免疫组佐剂作用不明显.
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我国诺如病毒SZ9711株P粒子制备及唾液HBGAs受体亲和性分析
目的 了解SZ9711株P粒子与唾液组织血型抗原受体(HBGAs)的结合模式.方法 从诺如病毒SZ9711株基因组中克隆P区基因片段并构建pGEX-4T-1原核表达质粒,在原核细胞中表达目的 重组蛋白并纯化,经溶血酶酶切后释放目的 蛋白.用EIA方法测定SZ9711株和VA387株P粒子与唾液HBGAs的结合情况.结果 SDS-PAGE电泳分析确定重组融合蛋白的表达,经纯化和凝血酶切后获得约38×10~3的目的 蛋白P蛋白.根据EIA分析表明,SZ9711株P粒子与先前报道的VA387株P粒子与唾液HBGAs模式相同,与A、B和O~(secretor)有亲和力,但与O~(non-secretor)亲和力非常低.同时,SZ9711与A抗原的亲和力较VA387与A抗原的亲和力低.结论 本研究利用我国分离到的SZ9711株制备的P粒子进行唾液HBGAs受体结合分析,表明与同源性较高的先前报道的VA387 P粒子结合模式相似,为今后研究诺如病毒与宿主受体之间的关系奠定实验基础.
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耐核糖核酸酶内含长片段嵌合体RNA的病毒样颗粒的构建和表达
目的 通过改变原噬菌体ms2包膜蛋白RNA包装位点(19碱基的茎环结构)的数量及亲和力,构建新的原核表达系统,探讨表达内含长片段(达到理论上的1 900 bp)RNA的耐RNase病毒样颗粒的可能性.方法 首先设计含Hind Ⅲ和Not Ⅰ酶切位点的引物,扩增ms2包膜蛋白的编码成熟酶蛋白和衣壳蛋白的1 700 bp序列,并将原来的19mer的包装位点序列改变为C-5变异体(19 bp stem-loop结构中-5位的尿嘧啶改变为胞嘧啶),Hind Ⅲ和Not Ⅰ酶切后,与用同样酶切的表达载体pET-28(b)相连接,得到重组载体pET-ms2-pac.应用重叠PCR扩增3种病毒的5段嵌合体序列(包括3段SARS-CoV基因、一段HCV基因和一段HSN1基因),并在SARS-CoV3和HCV序列之间插入一个19mer的变异体包装位点序列,在设计引物时,使嵌合体两端含有Not Ⅰ酶切位点,与Not Ⅰ酶切的重组载体pET-ms2-pac相连接,构建得到具有2个变异包装位点的表达载体pET-ms2-3V.同时构建3种对照重组表达载体,分别测定N-P3V-pET-P、N-P3V-pET-C、P-3V-pET-P和pET-ms2-3V 4种重组表达质粒表达产物的260 nm吸光度(A260)值,根据公式A160=0.125 mg/ml计算4种表达产物的表达效率.结果 成功构建了4种原核表达载体:pET-ms2-3V、P-3V-pET-P、N-P3V-pET-P和N-P3V-pET-C.pET-ms2-3V和P-3V-pET-P经原核表达后得到含全长为1 891的5段嵌合体RNA的病毒样颗粒;N-P3V-pET-P、N-P3V-pET-C其原核表达产物病毒样颗粒中仅包装了1 200 bp的目的 嵌合体RNA.N-P3V-pET-P、N-P3V-pET-C、P-3V-pET-P和pET-ms2-3V的表达效率分别为0.23、0.35、0.35和0.51 mg/ml.N-P3V-pET-C比N-P3V-pET-P表达效率高52%,而pET-ms2-3V比P-3V-pET-P表达效率高38%.所包装的RNA具有耐RNase和DNase消化的特性以及良好的不同温度条件下的稳定性.结论 通过改变噬菌体ms2 RNA包装位点(19碱基的茎环结构)的数量,可构建能表达内含达到理论上的约1 900 bp外源RNA的耐RNase病毒样颗粒的原核表达载体平台.通过应用包装位点的变异体C-变异体,可以增加病毒样颗粒的表达效率.
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内含人前列腺特异性抗原mRNA的耐核糖核酸酶病毒样颗粒的构建和表达
目的构建原核表达系统,表达内含人前列腺特异性抗原(prostate specific antigen,PSA)mRNA部分序列的病毒样颗粒,该病毒样颗粒因噬菌体蛋白包被重组RNA而使其包裹的RNA具有耐核糖核酸酶(RNase)的特性.方法采用聚合酶链反应扩增人前列腺特异性抗原cDNA的部分保守区域,进行TA克隆后用限制性内切酶HindⅢ酶切获得所需要的目的片段,与用Hind Ⅲ酶切的表达载体pNCCL1相连接,构建一新的表达载体pNCCL1-PSA,再转化E.Coli BL21-DE3,用IPTG诱导表达噬菌体MS2包膜蛋白,包膜蛋白可进行自我组装成病毒样颗粒并将PSAmRNA部分序列包裹到病毒样颗粒内.结果成功构建得到了新的表达载体pNCCL1-PSA,经原核表达得到耐RNase的内含PSA mRNA部分RNA序列的病毒样颗粒.结论本研究得到的表达载体pNCCL1-PSA及原核表达系统,可以作为以后构建和制备耐RNase的PSA mRNA标准品和质控品的的平台,为实验室PSA mRNA的检测提供新的标准品及质控品.
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含轮状病毒NSP3基因病毒样颗粒的构建和表达
目的:通过改变MS2噬菌体衣壳蛋白RNA包装位点的亲和力,构建并表达含轮状病毒NSP3基因耐RNA酶的病毒样颗粒,并探讨其稳定性.方法:设计含Pvu Ⅰ和Kpn Ⅰ酶切位点的上、下游引物,扩增1 049 bp轮状病毒NSP3基因片段,并将包装位点-5位的U替换为C,提高与MS2衣壳蛋白作用的亲和力.用PvuⅠ和Kpn Ⅰ双酶切扩增的目的基因和pACYC-MS2表达载体,连接获得重组载体pACYC-MS2-NSP3,转化TOP10感受态细胞后用PCR验证阳性克隆并测序.阳性克隆转化BL21( DE3)细胞后表达含轮状病毒NSP3基因病毒样颗粒,用超声破碎、纯化获得表达产物,鉴定并讨论其稳定性.结果:成功构建pACYC-MS2-NSP3表达载体并获得了含轮状病毒NSP3基因病毒样颗粒,其可耐受DNA酶和RNA酶的降解,并在-20℃、4℃、室温25℃下10 d保持稳定.结论:通过改变MS2噬菌体衣壳蛋白RNA包装位点的亲和力,可以成功构建耐RNA酶的病毒样颗粒,本研究所构建的病毒样颗粒具有耐RNA酶的特性和良好的稳定性,为轮状病毒实时荧光定量逆转录-PCR的标准品和质控品的研究提供了一个可行的方法.
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肠道病毒71型类病毒颗粒在昆虫细胞Sf9中的表达
目的 构建含有肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)P1和3CD基因的嵌合型重组杆状病毒质粒,探讨3CD蛋白酶对P1蛋白的切割作用及形成类病毒颗粒(Virus-like particles,VLPs)的可能性.方法 将EV71的P1和3CD基因克隆至同一pFastBac Dual质粒上,转化感受态大肠杆菌DH10,构建重组杆状病毒质粒Bac-P1-3CD,转染昆虫细胞Sf9,制备重组杆状病毒,经SDS-PAGE、Western blot及电镜对目的 基因表达产物进行分析.结果 重组杆状病毒质粒Bac-P1-3CD经PCR鉴定证明构建正确.重组杆状病毒感染的Sf9细胞经SDS-PAGE分析,可见相对分子质量约39 000、32 000和26 000的特异条带,大小与EV71的VP1、VP0、VP3蛋白相符;Western blot分析可见与EV71 VP1蛋白大小相近的特异条带;电镜观察可见EV71类病毒颗粒.结论 EV71的P1和3CD嵌合基因可以通过重组杆状病毒在昆虫细胞中表达,3CD蛋白酶可以切割P1蛋白得到VP1抗原,并能形成类病毒颗粒.
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A型流行性感冒病毒非结构蛋白1与宿主细胞凋亡信号转导关系的研究进展
流行性感冒(流感)病毒基因组的非结构(NS)蛋白基因是其基因组中小的基因节段,它转录成的线性mRNA共编码两种蛋白质,即NS1和NS2蛋白.早期研究表明,这两种蛋白质仅存在于被流感病毒感染的细胞中,而在病毒粒子内则无,所以被称为NS蛋白.NS1蛋白主要表达于感染细胞核内[1],在感染早期大量合成;NS2蛋白主要在胞质内表达,后期才会合成产生,在成熟的病毒粒子中仅少量存在.NS1蛋白参与调节病毒RNA的合成,前mRNA的运输、剪切及mRNA的翻译过程.早期研究提示,NS1蛋白在流感病毒感染的不同阶段或同时具有抑制宿主细胞蛋白合成、加强病毒蛋白合成的作用,被广泛认为是A型流感病毒对抗机体免疫反应的毒力因子之一,对流感病毒的毒性发挥非常重要的作用.
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含HPV16 E7的病毒样颗粒诱导小鼠产生特异性CTL反应
目的探讨含BPVL1/HPV16 E7嵌合型乳头瘤病毒样颗粒(VLPs)在动物小鼠体内的免疫学特性.方法将HPV16 E7基因分为(a)、(b)、(c)3段,与BPVL1连接后表达的BPVL1/HPV16 E7(a)、(b)、(c)嵌合型VLP分别免疫小鼠C57BL/6J,对其淋巴结淋巴细胞进行细胞毒性T淋巴细胞反应(CTL)分析.结果接受嵌合型VLP BPVL1/HPV16 E7(b)免疫的小鼠淋巴结淋巴细胞可以引发很强的对C-2细胞(HPV16 E7aa47-59转染的EL-4细胞)的特异性CTL反应,但不能对EL-4细胞产生细胞毒性作用.结论含BPVL1/PV16 E7嵌合型VLP作为抗原输送系统致敏小鼠T淋巴细胞并引发抗原特异性CTL反应,可能为HPV疫苗的设计提供一个新手段.
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猪流感病毒血凝素研究进展
猪流行性感冒,简称猪流感(Swine influenza, SI),是猪的一种急性、高度接触性呼吸道传染病.自美国1918年首次报道本病以来,欧、美、亚、非、澳等世界各大洲均有本病的发生和流行.SI能引起猪的高发病率(几乎100%)和低死亡率(病死率≤1%).此病的发生可使患病猪生产性能下降,推迟上市;还可引起呼吸道细菌和病毒继发或混合感染,使疫情更为严重,造成猪只死亡.其病原为猪流感病毒(Swine influenza virus,SIV),属于正黏病毒科A型流感病毒属,病毒粒子呈多形态,不过多数呈球形,直径约80-120nm.个别丝状体可长达数微米,常见于刚分离到的病毒颗粒,鸡胚或细胞内反复传代繁殖后变为球形.病毒有囊膜,由双层类脂膜、糖蛋白突起和基脂蛋白组成.囊膜表面有许多放射状排列的突起,即纤突和刺突.病毒颗粒内为核衣壳,呈螺旋状对称,直径为10nm.两端具有环状结构,存在于病毒的囊膜内.
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含人甲胎蛋白mRNA部分序列的耐核糖核酸酶病毒样颗粒的构建和表达
原发性肝癌为一种严重威胁人们健康的恶性肿瘤.甲胎蛋白(AFP)mRNA在监测原发性肝癌的肝外转移以及术后复发方面是一个很好的标志物,也可用于肝癌治疗效果的评价.通常AFP mRNA的检测方法为逆转录巢式聚合酶链反应(RT-PCR)法进行定性检测,或利用凝胶电泳扫描的方法进行半定量检测.近来随着实时荧光PCR技术的发展使得准确定量检测AFP mRNA成为可能.
