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丙型肝炎病毒不同基因型核心蛋白对肝母细胞瘤细胞凋亡影响的比较
目的：比较HCV不同基因型核心蛋白（core）在肝母细胞瘤细胞凋亡中的作用。方法构建6a基因型HCV core的表达载体pcDNA3.1/myc-His（-）-core（6a）[pCore（6a）]；分别将1b、3a和6a基因型HCV core质粒以及空质粒pcDNA3.1/myc-His（-）（pNC）瞬时转染HepG2细胞，48小时后利用流式细胞术检测细胞凋亡发生的情况；利用Real-time PCR检测胱冬肽酶-3的mRNA水平变化；利用化学发光法检测胱冬肽酶-3的活性变化，比较HCV不同基因型core对细胞凋亡作用的差异。结果成功构建了6a基因型HCV core的表达载体pcDNA3.1/myc-His（-）-core（6a）[pCore（6a）]；与pNC组相比，表达1b、3a和6a基因型HCV core的HepG2细胞中，Annexin V＋细胞数均显著减少，其中6a基因型core较1b和3a基因型core作用显著（P ＝0.000、0.001）；同时实验组中凋亡效应分子胱冬肽酶-3的mRNA水平及其活性较对照组均降低；其中与1b和3a基因型core相比较，6a基因型core显著降低胱冬肽酶-3的mRNA水平，而在抑制胱冬肽酶-3活性方面无显著差别。结论HCV不同基因型core对细胞凋亡的作用不同；基因6a型core对细胞凋亡的抑制作用更为显著；HCV基因6型核心蛋白可能更易导致肝癌的发生，有待进一步研究。
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丙肝病毒感染与细胞凋亡(文献综述)
p53基因是一种抑癌基因,NF-κB是一种核转录因子,两者均与肿瘤细胞凋亡密切相关.近来研究发现丙肝病毒核心蛋白可引起的p53基因突变和NF-κB激活,与拮抗细胞凋亡有关,对HCV持续感染和致癌可能起到重要作用,为丙肝病毒感染的病因和防治提供了新的线索.
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HCV核心蛋白通过LXRα核受体介导HepG2细胞甘油三酯合成增加
目的：观察丙型肝炎病毒（HCV）的核心蛋白（core）对肝细胞甘油三酯（TG）合成的影响。方法将HCV 1b基因型core表达载体pcDNA3.1-myc/his（-）-core1b和HCV 3a基因型core表达载体pcDNA3.1-myc/his（-）-core3a分别转染至HepG2细胞，利用定量测定法检测细胞内TG含量，用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应法（real time qPCR）、蛋白免疫印迹（Western blot）方法观察脂质合成相关基因肝X受体α（LXRα）、甾醇调节元件结合蛋白1c（SREBP1c）和脂肪酸合酶（FASN）的mRNA和蛋白的表达变化，并进行比较分析。结果 HepG2细胞转染两个基因型HCV core表达载体之后均能显著增加细胞内的TG含量（P＜0.05），尤以基因型core3a组为差异更显著（P＜0.001）。Real-time PCR结果显示，两个基因型core均上调LXRα的mRNA水平（P＜0.05），基因型core3a组差异更为显著（P＜0.01）；FASN的mRNA水平只在仅在基因型core3a组上调（P＜0.05），而基因型core1b组差异无统计学意义。Western blot结果显示，HCV core表达可以明显上调表达可以显著上调SREBP1c的蛋白水平，尤其基因型core3a组更为显著。对FASN蛋白水平，基因型core3a上调其表达，但基因型core1b组无明显变化。结论 HCV可能通过LXRα介导肝细胞内的脂质合成诱导肝脂肪变，有待进一步研究。
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基因1b型不同准种株HCV核心蛋白原核表达质粒pTrc-CKS构建及诱导表达
目的 为研究与不同准种HCV 核心蛋白(Core)相互作用的细胞蛋白质组,构建并表达基因1b型的不同准种Core的原核表达质粒pTrc-CKS.方法 用聚合酶链反应(PCR)扩增并获得等长度片段的基因1b型的不同准种株丙型肝炎病毒(HCV)Core基因,氨基酸(aa)长度分别为癌中心株(T):1～172 aa、癌旁株(NT):1～172 aa及C191(HCV-J6):1～172 aa.扩增产物用Bam HⅠ及Eco RⅠ双酶切后插入到原核表达质粒pTrc-CKS中.阳性克隆转化到大肠埃希菌Top 10F'中,异丙基-β-D-S-代半乳糖苷(IPTG)诱导表达获得融合蛋白CKS-Core-His,经Ni2+10F'柱纯化并经Western blot验证.结果 PCR及双酶切验证表明3个基因为1b型的不同准种Core基因成功构建到原核质粒pTrc-CKS中,体外诱导并获得了相应的融合蛋白.结论 构建不同准种Core基因的原核表达质粒获得成功,体外诱导表达并纯化获得了CKS-Core-His融合蛋白,为后续研究与Core相互作用的细胞蛋白质组奠定了基础.
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丙型肝炎病毒核心蛋白在大肠埃希菌中的表达及其纯化
目的 建立稳定表达丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白的原核表达系统,获得高产量的纯化核心蛋白.方法 以HCV株全长Cdna 序列为模板,PCR扩增获得核心蛋白基因,构建原核表达载体Pet-32a(+)-HCV-Core.转化大肠埃希菌DH5α,提取质粒,验证正确后,再次转化大肠埃希菌BL21中,IPTG诱导表达,SDS-PAGE、Western blot验证融合蛋白的表达.超声破碎表达菌,Ni+-亲和柱对表达蛋白进行纯化及柱上复性.结果 成功构建了原核表达载体Pet-32a(+)-HCV-Core,并表达了预期分子量大小的目的蛋白.结论 成功表达、纯化HCV核心融合蛋白,为进一步研究其生物学功能奠定了坚实的基础.
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中国株HIV-1 gag基因核酸疫苗免疫小鼠的实验研究
目的研究开发针对我国人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)流行株的艾滋病治疗性疫苗,构建含中国流行株HIV-1核心蛋白(gag)基因的核酸疫苗,并评价其诱导的体液和细胞免疫反应效果.方法将HIV-1 gag基因插入到真核表达载体pCI-neo中,构建了真核表达质粒pCI-neo GAG,并经XbaⅠ/SalⅠ双酶切及测序鉴定.将pCI-neo GAG和空载体pCI-neo免疫BALB/c小鼠,通过ELISA检测免疫小鼠的特异性抗体和IFN-γ,通过MTT实验检测免疫小鼠脾淋巴细胞增殖实验,通过乳酸脱氢酶(LDH)实验检测小鼠特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应.结果酶切及测序结果表明成功地构建了HIV-1 gag基因核酸疫苗;与空载体pCI-neo组比较,pCI-neo GAG免疫组小鼠血清的抗HIV-1 p24抗体滴度和IFN-γ均升高(P＜0.01).pCI-neo GAG免疫组小鼠的脾淋巴细胞增殖实验刺激指数(SI)以及特异性CTL活性均高于空载体pCI-neo组(P＜0.01).结论构建的针对我国HIV-1流行株的gag基因核酸疫苗免疫小鼠可以诱导特异性体液和细胞性免疫应答,为进一步研制适用于我国的HIV治疗性疫苗奠定了基础.
关键词： 人类免疫缺陷病毒-1 核心蛋白 核酸疫苗 免疫 -
丙型肝炎病毒核心蛋白反式激活基因TAHCCP1的克隆化研究
目的筛选并克隆丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白(core)反式激活的新型靶基因.方法以HCV核心蛋白表达质粒pcDNA3.1(-)-core转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照,提取mRNA并进行抑制性消减杂交分析.分析筛选出来的基因,其中之一与GenBank中注册的已知功能基因序列没有同源性.通过序列同源性搜索比对及电子拼接,根据基因起始密码子的Kozak规则和终止密码子下游保守的多聚腺苷酸信号序列,确定新型基因序列.从转染pcDNA3.1(-)-core的HepG2细胞提取总RNA,以RT-PCR技术扩增获得该新基因的全长序列,并对克隆的基因及其编码产物的序列进行分析.结果该新基因的编码序列全长为2 001nt,编码产物由667aa组成,并测序证实,命名为TAHCCP1,在GenBank中注册,注册号为AY038359.结论发现并鉴定、克隆了HCV核心蛋白反式激活作用的新型靶基因TAHCCP1,为进一步研究HCV核心蛋白反式激活作用的分子生物学机制和探索新型治疗技术奠定了基础.
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丙型肝炎病毒核心蛋白可溶性单链可变区抗体在大肠杆菌中的表达
利用分子生物学技术,构建表达丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白的人源单链可变区抗体(ScFv)的原核表达载体,并在大肠杆菌JM109中表达可溶性的HCV-core-ScFv.以重组的HCV核心蛋白为包被抗原,利用噬菌体抗体库的表面展示技术,筛选到含有HCV-core-ScFv基因的噬菌体克隆.从噬菌体抗体阳性克隆中提取质粒,经NcoI/Not I酶切鉴定,该ScFv基因由750bp组成.将其亚克隆到pCANTAB5E表达载体中,转化大肠杆菌JM109,提取质粒进行DNA序列测定,符合ScFv的重链可变区和轻链可变区基因结构特点.IPTG诱导转化的大肠杆菌JM109,在其培养上清中获得了可溶性HCV-core-ScFv的表达.酶联免疫吸附法(ELISA)证实表达的HCV-core-ScFv具有重组HCV核心蛋白的反应活性和特异性.对转化的JM109大肠杆菌上清中表达的HCV-core-ScFv进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE),证实表达的HCV-core-ScFv的分子量为28kDa.为应用HCV-core-ScFv进行肝组织免疫组织化学和细胞内免疫基因治疗研究奠定了基础.
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应用基因表达谱芯片筛选丙型肝炎病毒核心蛋白反式调节基因
应用基因表达谱芯片技术对HCV核心蛋白表达质粒pcDNA3.1(一)-core转染的HepG2细胞和空载体处理的相同细胞差异表达的mRNA进行检测.基因表达谱芯片所检测的1 152条目的基因均为GenBank中登录的基因,HCV核心表达质粒转染的细胞有95条差异表达基因,其中45条基因表达增强,50条基因表达降低.这些核心蛋白反式调节基因与细胞增殖、分化、凋亡、信号转导及免疫调节密切相关.本实验结果为进一步阐明HCV核心蛋白致病(癌)的分子生物学机制提供了理论依据.
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应用噬菌体表面展示技术筛选丙型肝炎病毒核心蛋白抗原模拟表位
为筛选丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白(core)特异性噬菌体12肽模拟表位,应用噬菌体表面展示技术,以抗-HCV核心蛋白抗原的单克隆抗体作为固相筛选分子,对人工化学合成的噬菌体随机12肽库进行5轮"吸附-洗脱-扩增"的筛选过程,随机挑取50个克隆,经噬菌体酶联免疫吸附法(ELISA)鉴定,并进行交叉反应实验以及竞争抑制性结合实验,后对所选克隆进行DNA序列分析,以确定HCV核心抗原的模拟表位.经免疫学鉴定后,从随机筛选的50个克隆中确定10个阳性克隆,进行DNA序列测定,确定氨基酸序列XRQXXPXXXHXX为HCV核心的模拟表位.本实验为开展用HCV模拟表位探索HCV的防治研究创造了条件.
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丙型肝炎病毒核心蛋白抗独特型人源单链可变区抗体的筛选与鉴定
为制备抗丙型肝炎病毒核心蛋白的抗独特型单链可变区抗体(抗-Id scFv),采用噬菌体表面展示技术,将抗-HCV核心蛋白的单克隆抗体固相包被于Nunc板,从噬菌体单链可变区抗体库中经过5轮"吸附-洗脱-扩增"筛选过程,获得可与HCV核心蛋白单克隆抗体结合的抗独特型人源单链可变区抗体的噬菌体集落.随机挑选60个克隆,利用酶联免疫吸附法(ELISA)、交叉反应和竞争抑制实验,对其进行免疫学检测和鉴定.获得与HCV核心蛋白单克隆抗体结合活性较强的抗-Id scFv阳性克隆,并对HCV核心蛋白特异性抗-Id scFv的编码序列进行测定分析.结果经过5轮"吸附-洗脱-扩增"筛选,在随机挑选的60个克隆中,有20株克隆ELISA的吸光度(A450nm)值较高,这些噬菌体上清与牛血清白蛋白(BSA)进行交叉反应后,确定了其中有6株交叉反应较弱,结合2次ELISA重复实验的A值及竞争抑制实验结果,后确定1株阳性克隆,提取质粒,进行DNA序列测定,DNA大小为768 bp.本实验结果提示用噬菌体抗体库技术能够成功地获得抗-HCV核心蛋白的抗-Id scFv,为开展用抗-Id scFv防治慢性丙型肝炎的研究创造了条件.
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丙型肝炎病毒核心蛋白结合蛋白的研究进展
丙型肝炎病毒的慢性感染是肝细胞癌发生的主要危险因素之一,核心蛋白在致癌过程中可能发挥了重要的作用.本文综述了近年来对丙型肝炎病毒核心蛋白特性及其相互作用蛋白的研究进展,尤其是针对核心蛋白与肝癌的发生和发展的关系作了较详细的探讨.
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丙型肝炎病毒1b基因型C区氨基酸70替代对细胞凋亡的影响
目的 探讨丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV) 1b基因型(genotype 1b,GT-1b)C区氨基酸(amino acid,AA) 70替代对细胞凋亡的影响.方法 利用前期构建的HCV GT-1b C区aa70野生型和变异型核心蛋白表达质粒瞬时转染体外培养肝瘤细胞系,采用PCR芯片检测细胞凋亡相关基因的表达,并以Annexin-V FITC/PI双染色法检测细胞凋亡率.结果 与野生型核心蛋白相比,转染表达变异型核心蛋白可使Huh7细胞84个凋亡相关基因中40个表达相对增强,44个表达相对减弱,但相差倍数均在3倍以内.HepG2细胞转染野生型和变异型核心蛋白表达质粒后,细胞凋亡率分别为9.4％±1.9％、9.1％±2.2％,低于空白载体对照组的14.3％±1.4％;以抗Fas抗体处理后,细胞凋亡率增高(52.4％±2.9％、56.1％±2.5％),但仍明显低于空白载体对照组的72.6％±2.1％.结论 HCV核心蛋白表达可抑制细胞凋亡,但核心蛋白单纯R70Q/H变异并不足引起细胞凋亡相关基因表达及凋亡率的显著不同.
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丙型肝炎病毒1b基因型C区氨基酸70替代对干扰素刺激应答元件的影响
目的 探讨丙型肝炎病毒(hepatitis C Virus,HCV) 1b基因型(genotype 1b,GT-1b)C区氨基酸(amino acid,aa)70替代对干扰素刺激应答元件(interferon-stimulated response element,ISRE)的影响.方法 首先构建HCV GT-1b C区aa70野生型和变异型核心蛋白表达质粒,测序鉴定后瞬时转染肝瘤细胞系Huh7细胞,Western blot法鉴定HCV核心蛋白的成功表达;然后利用ISRE双荧光素酶报告基因实验检测核心蛋白表达对ISRE活化的影响,并以SYBR Green real-time PCR检测3种主要干扰素刺激基因(interferon stimulated genes,ISGs)的表达情况.结果 构建了HCV aa70野生型和变异型核心蛋白表达质粒,并在体外培养细胞中成功表达.但野生型和变异型核心蛋白表达对ISRE活化及3种主要ISGs表达的影响无明显差异.结论 单纯R70Q/H变异的核心蛋白似乎并不足以直接导致IFNα耐药.
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靶向乙肝病毒核心蛋白治疗慢性乙型肝炎的研究进展
乙型肝炎病毒(HBV)核心蛋白是HBV核衣壳的组成部分,参与病毒包装、病毒成熟以及病毒向细胞外释放等过程,具有cccDNA调节功能并参与诱导机体免疫反应.本文就HBV核心蛋白的结构、功能以及在HBV治疗中的研究进展等方面,综述了近年来靶向HBV核心蛋白治疗慢性乙型肝炎的研究现状,表明核心蛋白质变构调节剂(CpAMs)可作为抗HBV药物直接靶向HBV核心蛋白而干扰其活性,利用HBV核心蛋白为靶抗原诱导HBV特异性免疫反应具有抗HBV及免疫调节作用,以期为慢性乙型肝炎的治疗发展提供参考.
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丙型肝炎病毒基因免疫重组真核表达质粒构建的初步研究
目的:利用真核表达载体pCDNA3.1(+)与HCV核心区基因重组,为进一步表达蛋白打基础.方法:首先从1例HCV感染者血清中用反转录-PCR法获得全长的核心区基因并测序,继而将其克隆到原核表达载体pQE-30上并使之在大肠杆菌中得到表达,然后将核心区基因与真核表达载体pCDNA3.1(+)重组,构建重组体.结果:HCV核心区基因为HCVⅡ型,将其克隆到原核表达载体pQE-30上并使之在大肠杆菌中得到表达,分子量为22KD,表达量占菌体蛋白的8.7%.然后将核心区基因与真核表达载体pCDNA3.1(+)重组,构建了pCDNAHCVc191和pCDNAHCVc-hIL2两种重组体.结论:pCDNAHCVc191和pCDNAHCVc-hIL2两种重组体,尤其后者是核心区基因与人白介素-2基因融合,可引发更好的基因免疫效果.上述工作奠定了整个HCV基因免疫研究的基础.
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SNARE和synaptotagmin对学习记忆作用的研究进展
可溶性NSF附着蛋白受体(SNARE)复合物是神经元囊泡胞吐过程重要的一部分,一般认为它参与调节突触前膜融合过程.SNARE复合体核心蛋白主要有3个,突触小体相关蛋白(SNAP-25),syntaxin和囊泡相关蛋白(VAMP).突触结合蛋白(synaptotagndn,syt)是一个钙感受器蛋白,通过和SNARE结合起到调控膜融合过程的作用.SNARE复合物中的syntaxin,SNAP-25以及svt基因的缺失可造成小鼠认知以及学习记忆损伤.本文主要综述两者在突触前膜的作用过程,并分析其对学习记忆的影响与其调节突触前膜融合过程密切相关,以期了解syntaxin,SNAP-25及syt影响学习记忆的分子机制.
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HIV-1核心蛋白p24在大肠杆菌中的表达与纯化
目的:探索进一步提高 HIV-1 p24 gag 蛋白在大肠杆菌中的表达效率,增加产物的纯化手段.方法:通过改造原核表达载体 pBV220和 pET28,构建了一种新的通用型温控原核表达载体 pVV5,将 HIV-1 gag 基因的 1 148～1 857 编码序列,插入到 pVV5b 和 pET28b 的相应位点中,构建了重组表达质粒 pEG1b 和 pEG7b,转化到大肠杆菌中进行表达,产物利用 IMAC 金属螯合层析柱进行纯化,纯化的表达产物用 HIV-1 标准阳性血清进行鉴定.结果:构建的重组表达质粒 pEG1b 和 pEG7b 在相应受体菌中表达重组蛋白的量为41%和28%,表达的外源蛋白经 IMAC 柱一步纯化后纯度超过80%,纯化后的重组蛋白可与 HIV-1 阳性血清发生 ELISA 反应.结论:构建的通用型温控原核表达载体可以高效地表达外源蛋白,在大肠杆菌中高效地表达 HIV-1 p24 可用于制备 HIV-1 感染的诊断试剂.
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抗土拨鼠肝炎病毒核心蛋白单克隆抗体的制备、性质鉴定及初步应用
目的:研制出能特异与土拨鼠肝炎病毒核心蛋白(WHc)结合的单克隆抗体,使之能特异性地对土拨鼠肝炎病毒(WHV)进行检测,并可能应用于相关肝炎病毒的筛查.方法:以原核表达的土拨鼠肝炎病毒重组核心蛋白(WHc 1～149氨基酸)免疫BALB/c小鼠,常规杂交瘤技术进行细胞融合,有限稀释法克隆化,间接酶联免疫吸附试验(ELISA)和免疫组织化学(IHC)筛选、鉴定.结果:筛选出5株(4B1E、6C5D、6C5C、6D1D、6D1G)能稳定分泌抗土拨鼠肝炎病毒核心蛋白抗体的杂交瘤细胞株.此5株单抗适用于ELISA、IHC、Western blot等方面的研究,与HBcAg有交叉反应,并且在部分中国旱獭的肝脏组织进行IHC检测呈现阳性反应.结论:制备的5株单抗可用于土拨鼠肝炎病毒等嗜肝脱氧核糖核酸病毒的研究,可能在寻找新的相关肝炎病毒中起重要作用.
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丙型肝炎病毒NS5A蛋白功能的研究进展
丙型肝炎病毒(HCV)可引起肝炎、肝硬化和肝癌等一系列肝脏疾病,且慢性化几率较高.目前全世界HCV感染人数仍呈增加趋势,因此科学家对HCV的研究高度重视.HCV有一个大的开放阅读框编码约三千多个氨基酸的多聚蛋白,经蛋白酶裂解为十个多肽片段;氨基末端为结构蛋白包括有核心蛋白、包膜蛋白E1和E2、P7蛋白;羧基末端为非结构蛋白包括有NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NSSB蛋白.基中NS5A蛋白位于HCV多聚蛋白前体的1973-2419氨基酸区域,由447个氨基酸组成,氨基末端为双亲性α螺旋可与内质网膜结合.
