首页 > 文献资料
-
人类肠道病毒68型3A蛋白可溶区的表达及其结构初步研究
为了解人类肠道病毒68型3A蛋白可溶区的结构,本研究构建了EV-D68 3A蛋白可溶区的原核表达载体,在大肠杆菌中表达、纯化并对其结构进行了初步研究.首先,采用PCR的方法扩增EV-D68 3A(1～61)基因片段,克隆至原核表达载体pET-28a-His-SUMO中,转化进入BL21(DE3)感受态细胞,诱导表达出His-SUMO-3A(1～61)融合蛋白.经Ni NTA树脂亲和层析初步纯化后得到大量融合蛋白,利用ULP酶酶切去除His-SUMO标签,通过Ni-NTA树脂亲和层析、阴离子交换层析柱、分子筛层析等方法分离标签并进一步纯化目的蛋白.后通过化学交联反应检测目的蛋白的多聚化状态.结果显示,利用pET28a-His-SUMO-3A(1～61)原核表达载体能够在大肠杆菌中成功表达出大量可溶性的融合蛋白;经过多步纯化方法得到了大量高纯度的目的蛋白,平均每升大肠杆菌可得到约5mg目的蛋白,纯度达95％以上;通过化学交联反应证明了该蛋白的多聚化存在形式.本研究成功建立了EV-D68 3A蛋白可溶区的表达和纯化系统,为进一步获得3A蛋白晶体、研究3A蛋白功能以及设计以3A为靶点的抗病毒药物奠定了基础.
-
肠道病毒68型的研究进展
肠道病毒68型(enterovirus D68,EV-D68)于1962年首次分离自患有肺炎和支气管炎的住院儿童.EV-D68属于病毒科,肠道病毒属,肠道病毒D组.自被发现后有关EV-D68的报道甚少,至2005年后才开始大规模的暴发.北美于2014年暴发了有史以来大规模的一次EV-D68流行.EV-D68感染儿童可引起咳嗽、喘息和血氧不足等急性呼吸道疾病.近暴发的急性驰缓性麻痹也被怀疑与EV-D68感染相关.本文对EV-D68的生物学特征、流行病学、致病机制和临床特征等研究进展作一综述.
-
肠道病毒EV-D68表面结构蛋白VP2、VP3的原核表达及其特异性分析
目的 原核表达肠道病毒68型(enterovirus D68,EV-D68)表面结构蛋白VP2、VP3,分析其亲和力和结合力,得到具备高结合力的、可结合特异性记忆性B细胞的EV-D68病毒表面结构蛋白.方法 采用PCR法扩增EV-D68病毒的VP2、VP3蛋白基因,插入原核表达载体pGEX-5X-1,构建重组表达质粒pGEX-5X-1-VP2和pGEX-5X-1-VP3,转化到工程菌Rosetta(DE3)pLy中,异丙基硫代半乳糖苷(i-sopropylβ-D-thiogalactoside,IPTG)诱导表达,表达的重组蛋白形成包涵体,经超声洗涤、透析复性;采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)电泳、Western-blot鉴定重组蛋白;竞争性酶联免疫吸附检测(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测蛋白VP2、VP3的蛋白活性和亲和力;藻红蛋白荧光素(phycoerythrin,PE)标记VP2和VP3重组蛋白,结合CD19-APC、CD27-FITC抗体,流式细胞术检测VP2、VP3蛋白结合特异性记忆性B细胞的情况.结果 成功构建出重组表达质粒pGEX-5X-1-VP2和pGEX-5X-1-VP3,通过双酶切鉴定及测序分析,确认表达载体构建正确,通过表达纯化,成功获得EV-D68的VP2、VP3蛋白,SDS-PAGE电泳灰度扫描显示,VP2蛋白的纯度可达80％,VP3蛋白的纯度可达75％;经Western-blot和ELISA鉴定,均有抗原特异性;通过竞争ELISA检测,VP2亲和力常数为2.7×107 M-1,为中等亲和力;VP3亲和力常数为3.25×106 M-1,为低亲和力;通过流式细胞术可以检测到病毒攻击小鼠后脾脏细胞中的特异性记忆性B细胞.结论 成功原核表达,复性纯化得到EV-D68 VP2、EV-D68 VP3蛋白,两个蛋白均具有较强的抗原特异性,利用流式细胞仪能检测到特异性记忆性B细胞.终获得了具有较强结合能力,可用于分选抗原特异性记忆性B细胞的EV-D68表面结构蛋白VP2、VP3,为研究VP2、VP3蛋白的中和抗原表位及其广谱中和抗体的分选检测打下了基础.
-
肠道病毒68型的研究进展
2014年,在美国暴发了肠道病毒68型(enterovirus D68,EV-D68)感染相关的急性呼吸道疾病,引起全球对EV-D68的广泛关注.EV-D68属于小RNA病毒科肠道病毒属,然而其某些生物学特性和流行规律却与典型肠道病毒不同.EV-D68可通过呼吸道传播,重症患者可表现与脊髓灰质炎相似的神经系统症状,且有一定的死亡率.该病原在世界多个国家和地区的流行为世界公共卫生安全提出了挑战.现对EV-D68流行概况、分子流行病学、血清中和抗体、交叉保护等方面的研究进展作一综述.
