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小鼠卵母细胞MII期核(纺锤体)移植后经体外受精正常产仔
目的：为研究和了解细胞核与细胞质的相互作用。方法：采用3%蔗糖预处理显示及去核法进行昆明白小鼠与C57BL/6小鼠(黑色)之间卵母细胞MII期核(纺锤体)的移植、电融合、体外受精-胚胎移植(IVF-ET)。结果：经3%蔗糖预处理卵母细胞的去核率达100%。完成MII期核移植的重构卵母细胞约17.6%完成电融合。IVF的受精率为82%。受精卵2-细胞胚胎的发育率为80%～90%，8个1～4细胞胚胎移入两只自然怀孕1 d的寄母小鼠(Km×Km)输卵管，其中1只孕鼠生下3只小鼠，其中2只黑色小鼠为MII期核(纺锤体)移植生产的小鼠。移植产仔率为25%。结论：实验结果证明了3%蔗糖预处理显示MII期核(纺锤体)及去核效果可达100%；电融合的重构卵母细胞可完成正常的IVF。为进行不同年龄和卵龄间的MII期核移植提供了一个模型。
关键词： 小鼠 卵母细胞 MII期核(纺锤体)移植 电融合 体外受精 -
猪体外成熟卵母细胞卵质膜电场行为的研究
目的研究体外成熟不同时间猪卵母细胞卵质膜的抗电击和电融合能力. 方法利用电刺激,显微操作与电融合方法分别对体外成熟不同时间猪卵母细胞的抗电击和电融合能力进行了研究. 结果 1.培养48h卵母细胞质膜的抗电击能力显著高于培养24h和36h的未成熟卵以及培养60h和72h的老化卵;2.体外成熟48h的卵母细胞,在进行同卵或异卵核体移值时,其融合能力强(融合率90%以上);3.将小鼠2、4、8细胞和桑葚期胚胎的卵裂球分别移入IVM 48h去核猪卵母细胞,电融合率(75%～88.6%)无统计学差异. 结论同细胞核与细胞质成熟一样,细胞膜也存在成熟问题.培养48h的猪卵母细胞质膜的抗电击能力和发生电融合的能力达到强.
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小鼠精子和球形精子细胞显微注射受精研究
目的研究动物受精机理. 方法以昆明白鼠为实验动物,利用显微注射技术,对精子和球形精子细胞的显微注射受精进行了研究.结果 1. 带下注射受精,注射4～6个精子的卵的受精率(32.5%)和卵裂率(25.0%)显著高于注射单个精子的卵的受精率和卵裂率(分别为12.5%和6.3%)(P＜0.05).2. 带下注射4～6精子后,有第1极体卵母细胞的存活率(69.6%)、受精率(32.5%)和卵裂率(25.0%)分别高于无第1极体卵母细胞的存活率、受精率和卵裂率(分别为64.4%、20.7%和13.8%),但两者无显著差异(P＞0.05).3.胞质内精子注射卵的存活率(21.4%)极显著低于带下注射卵的存活率(69.6%)(P＜0.01);而胞质内精子注射卵的受精率(35.5%)、卵裂率(32.3)%和囊胚率(20.0%)则高于带下注射卵的受精率(33.3%)、卵裂率(25.0%)和囊胚率(10.0%),但无显著差异(P＞0.05).4.将球形精子细胞注入经电活化处理的卵母细胞的透明带下,注射卵的存活率为90.5%,电融合率为34.6%,2-细胞分裂率为28.3%. 结论 1.注射精子的数量对小鼠带下注射的受精率和卵裂率有显著影响.2.卵母细胞中第1极体存在与否对小鼠带下注射的受精率和卵裂率无显著影响.3. 不同注射方法对小鼠卵的存活率有极显著的影响,而对受精率、卵裂率和囊胚率无显著影响.4. 本实验所采用的电融合条件,尚未满足多数球形精子细胞与卵母细胞融合之需要.
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利用四倍体胚胎补偿法制备ES小鼠的技术方法
目的 介绍四倍体胚胎补偿法制备ES小鼠技术的操作环节,加快该技术的推广应用.方法 综合分析近几年来国内外在小鼠四倍体胚胎与ES细胞嵌合的研究成果,并结合我们自己的实验结果,分析影响ES小鼠制备的各种因素.结果 四倍体胚胎不能正常发育至妊娠期末,通过四倍体胚胎与胚胎干(ES)细胞的嵌合可以得到完全由ES细胞发育而来的小鼠,即ES小鼠.同核移植小鼠相比,ES小鼠具有正常的形态、生理和神经特征.ES细胞和四倍体胚胎的遗传背景、ES细胞的生长状态、嵌合方法、培养基种类、体外培养环境、移植方法、继母母性等是影响ES小鼠生活力的重要因素.结论 利用四倍体胚胎补偿法可以简便而快速地从遗传修饰的ES细胞获得突变体小鼠,为研究基因功能和构建人类疾病动物模型提供了一条有效途径.
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四倍体胚胎发育阶段对胚胎干细胞嵌合体小鼠制备的影响
目的 探讨四倍体胚胎发育阶段对胚胎干细胞(ES)嵌合体小鼠制备的影响.方法 通过2-细胞胚胎电融合法制备四倍体胚胎,采用显微注射方法将ES细胞分别注入1-细胞、4-细胞、囊胚3个发育阶段的四倍体胚胎中.所用ES细胞分别为杂交系B6D2F1×129/Sv和近交系C57BL/6J,经胚胎移植和剖腹产以获得ES小鼠.结果 实验表明,2-细胞胚胎电融合率为92.45%,4-细胞胚胎发育率为93.51%,囊胚发育率为90.42%.杂交ES细胞注射四倍体囊胚获得22只ES小鼠,效率显著高于近交系ES细胞以及其他发育阶段的四倍体胚胎,ES小鼠与B6D2F1×129/Sv杂交小鼠毛色一致且具有正常生殖能力.结论 四倍体胚胎的发育阶段显著影响ES小鼠的制备.
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不同电融合和激活参数对猪体细胞核移植胚胎发育的影响
目的:摸索猪体细胞核移植佳的融合和激活条件.方法:利用体外成熟的去核猪卵母细胞为受体,颗粒细胞为供核细胞,透明带间隙注射法构建重构胚,对电融合和激活的参数(电场强度、脉冲宽度、脉冲次数、融合液中Ca2+浓度、联合激活参数)进行摸索.结果:发现在电场强度1.5 kV/cm,脉冲宽度30 μs,2次脉冲(间隔3 s),电融合液中0.1 mmol/L的Ca2+浓度下进行电激活,进而用(CB,7.5 μg/ml)+(6-DMAP,2 mmol/L)激活3.5 h发育率高,48 h卵裂率为72.5%,第6天桑葚胚率为35.1%;初次尝试了在胚胎培养前48 h加入0.05 mol/L的甘露醇来增加渗透压以减少电激活后重构胚的碎片化程度,但发现卵裂率及桑葚胚发育率与对照组差异不显著.结论:初步得到了适宜的猪体细胞核移植的融合和激活条件,为随后克隆胚早期发育基因的研究打下了基础.
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昆明小鼠四倍体胚胎的制作
目的 介绍一种简单易行的制作四倍体胚胎的方法.方法 取腹腔注射人绒毛膜促性腺激素 (hCG)后37～40h的小鼠2-细胞胚胎,应用电融合方法,制作四倍体胚胎.用CZB培养液对四倍体胚胎进行体外培养.结果 采用交流电((AC)3V/mm、直流电(DC) 140v/mm、脉冲宽度50s、一次脉冲进行融合,融合率为97%,囊胚率为72.7%.结论 电融合方法可以应用于制作四倍体胚胎.
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大鼠肝细胞与胰岛内皮细胞融合细胞系的建立及鉴定
目的 通过电融合法构建由肝细胞系及原代内皮细胞融合而成的杂交细胞.方法 利用EMS诱变构建BRL-3A HGPRT-缺陷型细胞;利用胆总管灌注法及胰酶消化法获得胰岛内皮细胞;利用CRY-3B细胞电融合仪及HAT筛选策略获得融合细胞;利用流式细胞仪对融合细胞的体积、细胞内颗粒密度及DNA含量进行检测;通过实时PCR及Western blotting检测融合细胞特异性基因的表达情况.结果 成功构建了一株由大鼠肝细胞系BRL-3A与原代大鼠胰岛内皮细胞融合而成的四倍体BRL-ies细胞.这株细胞既具有内皮细胞表型,表达CD31,又具有肝细胞特性,表达较高水平的谷氨酰胺合成酶.结论 肝细胞系BRL-3A可与原代内皮细胞融合形成较稳定的四倍体细胞,同时两者特征表型得以保留.
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1种新型功能性杂交胰岛β细胞系的建立
目的 通过应用基因转染及细胞融合技术构建永生化细胞,建立1种功能良好、无致瘤性、增殖可控的杂交胰岛β细胞系.方法 通过脂质体介导逆转录病毒载体SSR69转染至原代成纤维细胞中,筛选稳定表达SV40 LTag的永生化细胞.提取大鼠胰岛,通过胰蛋白酶及DNA酶裂解成单胰岛细胞.对永生化成纤维细胞及单个胰岛β细胞进行电融合,通过有限稀释法获得杂交胰岛β细胞克隆.比较杂交及正常β细胞内胰岛素的含量及对葡萄糖刺激胰岛素释放反应.通过RT-PCR及Western blot分析杂交胰岛β细胞中SV40 LTag、insulin、葡萄糖激酶(GK)及葡萄糖转运体-2(Glut-2)基因的表达.结果 建立的永生化成纤维细胞系的增殖能力明显优于原代成纤维细胞(P＜0.05).成功获得杂交胰岛β细胞克隆,其细胞呈短梭形或扁圆形,且具有贴壁生长等特性.透射电子显微镜下可见细胞内胰岛素分泌颗粒,杂交与正常胰岛β细胞之间细胞内胰岛素含量、胰岛素释放指数及insulin、GK、Glut-2蛋白及mRNA表达水平无统计学差异(P＞0.05),但2种细胞内insulin、GK、Glut-2的表达水平显著高于RIN-m5F细胞(P＜0.05).结论 可通过永生化成纤维细胞及单个胰岛β细胞电融合诱导生成杂交胰岛β细胞,且杂交细胞能够对葡萄糖的变化产生应答反应.
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不同融合方式对核移植后胚胎融合的影响
目的 本文是通过对核移植后胚胎融合时不同排队方式的影响进行研究,试图提高重构胚胎的融合率,以提高核移植的效率.方法 采用手动排队和交流电+手动方法两种不同的排队方式,将体细胞核移植后胞质体-核质体复合体融合.结果 体细胞核移植后得到的胞质体-核质体复合体融合时,采用手动和手动+交流电两种方法调正胞质体-核质体复合体,其融合率分别为38.5%和75.7%.结论 在核移植后胞质体-核质体复合体融合时,采用交流电+手动排队融合率明显高于手动排队.
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人卵母细胞与体细胞的电融合效率
目的 探索适合于人体细胞核移植的电融合参数,并比较不同类型和数目体细胞的电融合效率.方法 首先对体外授精(IVF)后的低评分胚胎行电融合,观察不同电融合参数下胚胎的融合及继续发育情况,确定适电融合参数;其次将1～2 个颗粒细胞或成纤维细胞置入IVF后未受精卵子的卵周隙(PVS)中,在适电融合参数下行电融合.结果 在两段交流脉冲间给予200 V、25μs的直流脉冲为本研究的适电融合参数;颗粒细胞与卵母细胞的电融合效率低于成纤维细胞(P＜0.05);在PVS中加入2个颗粒细胞,其单个颗粒细胞的电融合效率高于加入1个颗粒细胞(P＜0.05),而成纤维细胞则无差异.结论 低融合效率的体细胞与卵母细胞电融合时可通过增加PVS中体细胞的数目来提高融合效率.
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以卡介苗和MTB H37 Ra的原生质体为亲本制备融合菌株的实验研究
目的：以卡介苗（BCG）和结核分枝杆菌（MTB）国际标准无毒株H37Ra （H37Ra）的原生质体为亲本制备融合菌株。方法：制备及鉴定BCG和H37 Ra的原生质体；对荧光染色标记的亲本原生质体进行电融合，制备融合菌株，同时优化其制备和再生培养条件。结果：成功制备BCG和H37Ra的原生质体；FDA标记BCG原生质体呈黄绿色荧光，罗丹明B标记H37Ra原生质体呈红色荧光，激光共聚焦显微镜观察到电融合条件在电压E＝2．2 kV／cm、电击时间t＝0．8 ms，呈桔色荧光的融合子融合率高、活性好。结论：成功制备了以BCG和H37Ra原生质体为亲本的融合菌株。
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三阴乳腺癌细胞-树突状细胞融合疫苗的抗肿瘤免疫效应
目的 利用细胞电融合技术制备外周血来源树突状细胞(DC)和三阴乳腺癌细胞(MDA-MB-231)全抗原肿瘤疫苗,观察其特异性抗肿瘤免疫效应.方法 从健康人外周血中分离培养DC,利用电融合技术,将DC和三阴乳腺癌细胞融合；荧光显微镜观察融合疫苗的形态；流式细胞仪进行融合疫苗的表型鉴定；ELlSA试剂盒检测IL-12、IFN-y的分泌情况；CCK-8试剂盒测定融合疫苗刺激同源异体T淋巴细胞增殖和细胞毒性效应.结果 成功分离培养DC,其表面高表达DC的分子标记CD83、CD11c、CD86、HLA-DR;融合疫苗形态不规则,其表面共同表达DC和三阴乳腺癌的标记分子；T淋巴细胞增殖实验证明融合疫苗有很强的免疫刺激活性；细胞毒性实验证明融合疫苗具有比对照组更强的杀伤肿瘤细胞作用.结论 电融合技术成功诱导DC和三阴乳腺癌细胞融合,全抗原融合疫苗体外实验可显著增强抗肿瘤免疫效应.
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改进的核移植方法完成小鼠卵丘细胞重组胚的早期发育
目的建立一种快速、简便、有效且损伤小的核移植方法,研究来源于小鼠体细胞重组胚的早期发育.方法用尖锐的去核针在MⅡ期卵母细胞透明带上切开一个25 mm左右的小口,首先将第一极体挑出,再轻轻地挤压和负压吸引卵母细胞,去除包含有MⅡ期染色体-纺锤体复合体的少量细胞质.随后,将直径为10～12 mm的C57BL/6j小鼠卵丘细胞核注射到去核卵母细胞透明带下,构建供体核-卵母细胞复合体.用电融合的方法诱导复合体融合,并对重组胚激活.体外培养72 h,对重组胚发育到2细胞、4～8细胞和桑椹胚期等各阶段进行观察和计数.结果完成一个MⅡ期卵母细胞去核的平均时间为15 s;Hoechst 33342染色证明可以完全去除MⅡ期卵母细胞细胞核:去核成功率为95.5%,注核成功率为76.7%,供体核-卵母细胞复合体融合和重组胚原核形成率分别为68.2%和62.2%;重组胚体外培养72 h内发育到2细胞、4～8细胞和桑椹胚期的比率分别为57.5%、39.1%和27.6%;用2个微卫星位点D7Mit22和D4Mit204引物,扩增不同发育阶段重组胚的DNA片段,表明重组胚来源于供体卵丘细胞.结论应用改进的核移植方法,不仅可以有效地去除卵母细胞细胞核,去核成功率高,而且操作简便,去核迅速,对卵母细胞损伤小,是研究小鼠体细胞核移植的一种简便可行的新方法.
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不同电融合条件对小鼠卵丘细胞核移植重组胚融合和早期发育的影响
目的研究不同电融合条件对来源于小鼠卵丘细胞核移植重组胚的融合和早期发育的影响,寻找佳电融合参数.方法将直径10～12mm的C57BL/6j小鼠卵丘细胞核注射到去核卵母细胞透明带下,构建供体核-卵母细胞复合体.在不同电融合条件下诱导两者间的融合,并对重组胚激活以及随后发育的早期阶段包括2细胞、4～8细胞和桑椹胚进行观察和计数.结果电融合时电场强度或脉冲时间在一定范围内允许波动,变动范围分别是电场强度1 000～2000kV/cm和脉冲时程40～160 ms.低于容许范围的电融合参数会降低供体核-卵母细胞复合体的融合率,而高于容许范围的参数会导致供体核-卵母细胞复合体溶解乃至死亡.如果电融合参数在容许范围内,供体核-卵母细胞复合体的融合率无统计学差异,并且融合后重组胚的激活,以及发育至2细胞、4～8细胞和桑椹胚阶段的比率也无统计学差异.此外,脉冲重复次数以1～2次为佳.结论优化的电融合参数是决定供体核-卵母细胞复合体融合与重组胚激活的关键因素.
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卵裂球电融合方法制作小鼠多倍体胚胎
目的:探索制作小鼠多倍体胚胎的方法.方法:应用卵裂球电融合方法,制作小鼠四倍体和八倍体胚胎.结果:经卵裂球电融合得到的多倍体胚胎,在体外培养条件下,可以发育到囊胚,其囊胚的形态与正常二倍体囊胚无区别,但囊胚中的细胞数量随着染色体倍性的增加而减少.进行电融合时,电压强度直接影响到卵裂球的融合效率,适宜的电压强度与胚胎的染色体倍性存在一定的联系.结论:卵裂球电融合方法可以用来制作小鼠多倍体胚胎.
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利用废弃胚胎行人原核移植方法的初步建立
[目的]探索利用废弃胚胎进行人原核移植的方案.[方法]收集废弃多原核受精卵117个.用显微操作-电融合的方法构建原核移植重构胚胎.分别比较钙离子浓度0.05 mmol/L(n=39)和0.1 mmol/L(n=58)的两种电融合液以及电压分别为1 800 V/cm(n=58)和2 000 V/cm(n=20)的两种电场条件对重构合子融合率和发育的影响.[结果]操作成功率70.1%,融合成功率59.8%,得到43个卵裂胚胎,其中23个(53.5%)6细胞以上胚胎.共14个重构胚发育至8细胞或以上.得到3个囊胚.将电压由2 000 V/cm下降到1 800 V/cm,重构胚胎融合率、卵裂率和囊胚率的差异没有统计学意义(P>0.05),但6-细胞率明显上升(22.2%vs.60.9%,P<0.05).和钙离子浓度为0.05 mmol/L的融合液比较,0.1 mmol/L的融合液融合率明显上升(39.3%vs. 69.0%,P<0.05),卵裂率、6-细胞率和囊胚率皆无统计学差异(P>0.05).[结论]通过显微操作-电融合的方法,用废弃胚胎重构人核-质异质的胚胎模型,是可行的、经济的.
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三阴乳腺癌疫苗刺激T淋巴细胞增殖免疫效应观察
目的:利用细胞融合技术制备外周血来源树突状细胞(DC)和三阴乳腺癌细胞(MDA-MB-231)全抗原肿瘤疫苗,观察其刺激同源T淋巴细胞增殖作用.方法:从健康人的外周血中分离培养树突状细胞,利用电融合技术,将DC和三阴乳腺癌细胞融合；用荧光显微镜观察融合疫苗的形态；用流式细胞仪进行融合疫苗的表型鉴定；用CCK-8试剂盒测定融合疫苗刺激同源异体T淋巴细胞增殖效应.结果:成功分离培养DC,其表面高表达DC的分子标记CD11c、CD86、HLA-DR；融合疫苗的形态不规则,其表面共同表达DC和三阴乳腺癌的标记分子；T淋巴增殖实验证明融合疫苗具有很强的免疫刺激活性.结论:电融合技术成功诱导DC和三阴乳腺癌细胞融合,全抗原融合疫苗体外实验可显著增强同源T淋巴细胞增殖.
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微流控电融合芯片的研制及其在体细胞重编程中的应用
目的 开发高通量的细胞电融合平台,并通过此平台将小鼠胚胎干细胞(mouse embryonic stem cells,mESCs)与体细胞融合,探讨融合细胞的多能性.方法 本实验室自主研发微流控芯片,将转染了绿色荧光的mESCs与转染了红色荧光的NIH3T3细胞进行电融合,并计算其排队率与融合率.通过流式细胞仪筛选出表达两种荧光的融合细胞,观察融合细胞的表型.RT-PCR检测NIH3T3、mESC以及融合细胞的多能性基因(Nanog、OCT4、SOX2和LIN28)mRNA的表达水平.结果 自主研发了微流控芯片,构建了高通量的细胞电融合平台,通过此平台将mESCs与NIH3T3进行电融合,其排队率为(44.35±10.99)％,融合率为(59.88±20.03)％,融合细胞可形成类似于ESC样的克隆.RT-PCR法结果显示mESC和融合细胞均表达多能性基因Nanog、OCT4、SOX2和LIN28 mRNA,而NIH3T3不表达.结论 通过自主研发的微流控芯片,可实现mESCs与NIH3T3的高效融合,使体细胞重编程为多能性干细胞.
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小鼠体细胞植入卵胞质体技术方案的选择
目的:探讨几种不同的小鼠核移植方案的优劣及造成此差异的原因和解决途径.方法:①取8-10周龄昆明鼠成熟卵胞质体作为受体,颗粒细胞作为核供体,比较含糖及不含糖操作液对去核过程的影响;②透明带打孔法、透明带膨胀法和挤压法去核,对卵胞质体质量的影响;③比较直接注核和电融合得到的重构卵激活后出现类原核的数目及克隆胚胎发育的情况.结果:在2种操作液中的去核效率并无差异,但操作≥10 min时在含糖操作液中的去核死亡率高于不含糖操作液组(P＜0.05);在3种去核方法中,透明带打孔法的单个卵子平均去核所需时间较其他2种方法长(P＜0.05),挤压法的单个卵子平均去除胞质比例较其他2种方法高(P＜0.05);在注核方法中,使用直接注核法较电融合法导致注核后重构胚的死亡率高(P＜0.05),激活后出现2个及以上类原核的比例高(P＜0.05),但克隆胚胎发育情况优于电融合组(P＜0.05).结论:使用含糖操作液显核清晰,但应尽量缩短操作时间;透明带膨胀法是3种方法中对卵子胞质影响小的方法;直接注核较电融合法对卵子的激活作用小,克隆胚胎发育更好.
