首页 > 文献资料
-
抗氧化剂半胱氨酸对小鼠卵母细胞体外成熟及发育潜能的影响
目的 研究抗氧化剂半胱氨酸对小鼠卵母细胞体外成熟及发育潜能的影响,为进一步优化卵母细胞体外成熟培养体系提供理论依据. 方法 对照组采用基础体外培养液,共培养101枚GV期小鼠卵母细胞;实验组采用基础体外培养液+0.6 mmol/L半胱氨酸,共培养115枚GV期小鼠卵母细胞.观察两组卵母细胞的成熟率、谷胱甘肽的含量和线粒体内膜电位. 结果 对照组和实验组卵母细胞的成熟率分别为68.3％和80.0％,差别具有统计学意义(P＜0.05)；对照组和实验组卵母细胞平均谷胱甘肽含量分别为0.48±0.6 μg/L和0.51±0.5 μg/L,实验组谷胱甘肽含量略高,但两者无统计学差异(P＞0.05).线粒体内膜电位,对照组与实验组分别为0.04±0.003 △Ψm与0.39±0.020△Ψm,实验组线粒体内膜电位明显高于对照组(P＜0.05). 结论 抗氧化剂半胱氨酸对体外培养小鼠卵母细胞成熟有一定的促进作用,并可能会提高卵母细胞的发育潜能.
-
顺式高尔基体蛋白GM130影响小鼠卵母细胞纺锤体组装
目的 确定顺式高尔基体蛋白GM130对小鼠卵母细胞纺锤体组装的影响. 方法 免疫荧光法检测GM130在小鼠卵母细胞发育不同时期的亚细胞定位,并用免疫印迹法半定量检测其表达水乎;接着用微管解聚药物诺考达唑处理小鼠MⅠ卵母细胞,明确GM130与微管动力的关系.免疫印迹检测注射GM130特定的寡聚核苷酸(morpholino,MO)后卵母细胞中GM130的表达水平,免疫荧光法检测纺锤体的形态变化及中心体相关蛋白γ-tubulin和Plk1的定位. 结果 M130在卵母细胞减数分裂成熟的不同阶段有不同的特异性定位,主要集中分布在生发泡周围、纺锤体的两极和中体及分散于胞浆.GM130在MⅠ和MⅡ期与中心体相关蛋白p-MEK1/2共定位并与纺锤体的组装密切相关.免疫印迹试验表明GM130在卵母细胞发育的各个时期均有表达.降调GM130的表达后,纺锤体组装异常比例升高,且大多数为拉长的纺锤体;第一极体排出率下降,在排出的极体中,大极体的比率升高,并影响γ-tubulin和Plk1的正确定位. 结论 GM130可能作为一种微管组织中心相关蛋白调节纺锤体的组装.
-
顺式高尔基体蛋白GM130影响小鼠卵母细胞减数不对称分裂的研究
目的 确定顺式高尔基体蛋白(GM130)对小鼠卵母细胞纺锤体迁移及减数不对称分裂的影响. 方法 免疫荧光法检测GM130在小鼠卵母细胞的定位,活细胞工作站延时拍摄系统捕捉纺锤体在降调GM130表达后的的动态变化.结果 降调GM130的表达后,第一极体排出率下降,在排出的极体中,大极体的比率升高；但对微丝网络及微丝帽的影响不明显.向卵母细胞内注射β5-tubulin-GFP mRNA和GM130特定的寡聚核苷酸(morpholino,MO)的混合物后,用活细胞工作站延时拍摄系统证实了降调GM130会影响卵母细胞纺锤体的迁移,纺锤体单极拉长,并能与该侧的皮质接触,产生胞质分裂环,导致大极体排出.若拉长的纺锤体尚不能与皮质接触,则细胞阻滞在分裂中期Ⅰ(MI期),没有极体排出.另外,降调GM130的表达也会影响磷酸化丝裂原活化蛋白激酶激酶1/2(p-MEK1/2)在纺锤体极的定位,用丝裂原活化蛋白激酶激酶(MEK)的抑制剂U0126处理MI期的卵母细胞则发现GM130不再在纺锤体两极聚集,而是散在分布于胞浆. 结论 GM130可能参与丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路在小鼠卵母细胞纺锤体迁移及不对称分裂中起重要作用.
关键词： 顺式高尔基体蛋白GM130 小鼠卵母细胞 减数不对称分裂 纺锤体 -
蔗糖预处理去核:一种可靠的无损害小鼠卵母细胞MII期核去除法
小鼠是发育生物学中为有用的实验动物模型,特别是在核移植方面.自从1983年Mc-Grath等[1]报道成功地进行小鼠的核移植以来,已采用小鼠的4-8细胞期的早期胚胎细胞[2]、桑椹胚[3]、内细胞团和滋养层细胞[4]以及体细胞[5]进行了核移植,并获得了后代.作为核移植的受体,可采用去核的合子[1],2-细胞期胚胎[6,7]和去核卵母细胞[8].其中以去核卵母细胞使用为广泛,它可接受各个时期以及不同类型的供体细胞[9].但MII期小鼠卵母细胞的核(纺锤体)不能在相差显微镜下观察到[10].
-
香烟烟雾对小鼠卵母细胞染色质构型、DNA甲基化及相关基因表达的影响
目的 探讨香烟烟雾暴露对小鼠卵母细胞染色质构型、全基因组DNA甲基化及相关基因表达的影响.方法 将清洁级健康ICR雌鼠分成3组(对照组和香烟烟雾低剂量组、高剂量组),分别置于点燃0、1、2支香烟的染毒柜(容积18L)中,每天2次,每次1h,共4周.利用Hoechst 33342对细胞核染色,观察卵母细胞质量及染色质构型;间接免疫荧光法分析卵母细胞全基因组DNA甲基化模式,实时荧光定量PCR测定卵母细胞DNA甲基转移酶(DNA methyhransferases,DNMT)1、DNMT3a及DNMT3b基因的mRNA表达水平.结果 随着烟雾浓度的升高,去透明带卵母细胞直径显著减小(P＜0.05),核仁未包围(non surrounded nucleolus,NSN)染色质构型比例明显升高(P＜0.05).高剂量组卵母细胞DNA甲基化水平显著下降(P＜0.05).随烟雾浓度升高DNMT1表达量降低,DNMT3b在高剂量组中表达水平显著降低(P＜0.05).结论 香烟烟雾暴露可能通过改变卵母细胞染色质构型,降低DNA甲基转移酶的表达,使DNA甲基化水平下降,从而降低卵母细胞质量.
-
不同温度对小鼠卵母细胞纺锤体的影响
目的检测不同温度对卵母细胞纺锤体的影响.方法昆明系小鼠MII期卵母细胞和Balb/c 系小鼠MI期和MII期卵母细胞分别置于不同温度环境各10 min,利用LC-PolScopeTM纺锤体观测系统,观察卵母细胞纺锤体变化.结果环境温度45 ℃对卵母细胞纺锤体有不可逆影响;经41 ℃再恢复到37 ℃后的Balb/c系小鼠MI期卵母细胞纺锤体Retardance值显著高于其他对应组别(P＜0.05);25 ℃时的卵母细胞纺锤体Retardance值显著低于37 ℃于对照组(P＜0.05).结论小鼠卵母细胞纺锤体对温度变化敏感,体外操作时维持37 ℃环境是保持卵母细胞纺锤体正常生理功能的关键.
-
三氧化二砷对小鼠卵母细胞线粒体DNA氧化损伤作用及其机制
目的：研究三氧化二砷（As2O3）对小鼠卵母细胞线粒体DNA（mtDNA）的氧化损伤作用及其作用机制。方法①体外实验挤压正常小鼠卵巢获取卵母细胞，培养成熟后，分为As2O31和2μmol·L-1单独处理组、N-乙酰半胱氨酸（NAC）5 mmol·L-1处理组、2，2，6，6-四甲基哌啶-1-氧基（Tempo）1 mmol·L-1处理组、As2O31或2μmol·L-1+NAC 5 mmol·L-1共处理组、As2O31或2μmol·L-1+Tempo 1 mmol·L-1共处理组，培养20 h后，收集成熟卵母细胞进行后续实验指标测定。②体内实验雌性昆明小鼠ip给药，分为As2O31和2 mg·kg-1染毒组、As2O31或2 mg·kg-1+NAC 200 mg·kg-1组，每日1次，连续60 d，椎脱臼处死取卵母细胞。2′，7′-二氯荧光黄双乙酸盐荧光染色检测细胞内活性氧（ROS）水平；8-羟基脱氧鸟苷酶（8-OHdG）联免疫反应检测提取mtDNA中8-OHdG含量；Western蛋白印迹法检测DNA聚合酶γ（Polγ）和线粒体转录因子A（mtTFA）的蛋白表达；β-半乳糖苷酶（β-Gal）报告基因检测试剂盒检测溶酶体活力。结果①体外实验As2O3单独处理组小鼠卵母细胞中ROS和8-OHdG含量升高，Polγ和mtTFA蛋白表达水平降低（P<0.05）；而As2O3与NAC或Tempo共处理组卵母细胞中ROS含量减少，8-OHdG水平降低，Polγ和mtTFA蛋白表达水平显著上调（P<0.05）。②体内实验 As2O3单独处理组小鼠卵母细胞中ROS和8-OHdG含量升高，Polγ和mtTFA蛋白表达水平降低（P<0.05）；As2O3与NAC共处理组小鼠卵母细胞中ROS含量减少，8-OHdG水平降低，Polγ和mtTFA蛋白表达水平提高（P<0.05）。As2O3单独处理组体外培养的卵母细胞，β-Gal活力显著提高（P<0.05），而As2O3与NAC或Tempo共处理组β-Gal活力显著下降（P<0.05）。体内实验各处理组β-Gal活力无显著差异。结论砷暴露可诱导小鼠卵母细胞大量生成ROS，抑制线粒体基因组修复与复制相关因子Polγ及mtTFA的表达，同时改变溶酶体活力，终诱发mtDNA氧化损伤。
-
小鼠卵母细胞程序化和玻璃化冷冻效果的比较
目的 本实验通过建立小鼠的实验模型,比较程序化和OPS玻璃化冷冻效果,探讨卵子冷冻的具体方法 ,为卵子冷冻技术应用于临床提供实验依据.方法 通过促排卵获取小鼠MII期卵母细胞,随机分组,观察不同冷冻方法 、高浓度的冷冻保护液,对卵子的成活及进一步发育潜能的影响;不同的IVF前培养时间对冻融卵子的受精及继续发育的影响.结果 (1)OPS玻璃化冷冻组与程序化冷冻组的存活率、受精率、卵裂率及6-8cell胚形成率均无显著差异.(2)玻璃化冷冻组与暴露组的卵母细胞存活率分别为35.3%,100%,有显著性差异(P＜0.05).暴露组与对照组比较的受精率、卵裂率,无显著性差异(P＞0.05).而暴露组与对照组的6-8cell的胚形成率分别为41%,63%,两组比较,有显著差异(P＜0.05).(3)无论OPS玻璃化冷冻法还是程序化冷冻法,冻融后的培养2 h组和培养1 h组的,受精率、卵裂率,两组比较,均有显著性差异(P＜0.05).结论 本实验证实,OPS玻璃化冷冻法至少可以达到程序化冷冻法同样的效果,而OPS玻璃化冷冻法有好于程序化冷冻法的趋势.加之,其简便、省时、经济等优点,因而,更有发展前景.
-
探讨小鼠排卵后老化的卵母细胞对生殖发育的影响
目的 研究小鼠排卵后老化的卵母细胞对生殖发育的影响及其相关机制.方法 将小鼠腹腔注射促排卵药后获取的卵母细胞分成对照组和继续体外培养24 h后得到的老化组,采用孤雌激活检测卵母细胞的发育潜能,免疫荧光分别检测纺锤体的形态和活性氧的水平.结果 与对照组相比,老化组中的卵母细胞原核形成率明显下降(P＜0.05),二细胞胚胎形成率显著降低(P＜0.05),破碎的胚胎比例明显增加(P＜0.05),并出现异常的纺锤体表型(P＜0.05)和高浓度的活性氧(P＜0.05).结论 小鼠排卵后老化的卵母细胞的质量下降可能与氧化应激密切相关,从而影响了细胞的生殖发育能力.
-
不同卵龄对小鼠卵母细胞孤雌激活的影响
孤雌生殖一词早是由Oven于1849年提出,所谓孤雌生殖是通过人工刺激模拟受精过程,使卵母细胞在无精子条件下被激活,即无雄性配子的任何作用,由雌性配子产生胚胎,不论其是否发育成个体均称为孤雌生殖,又称为孤雌激活[1].
-
不同培养基对小鼠卵母细胞孤雌激活的影响
孤雌生殖(parthenogenesis)又称单性生殖,是一种生物学现象.是指没有雄性配子参与,而仅通过单个卵母细胞产生新个体的繁殖技术.后又被重新定义为在没有任何雄性配子的作用下,由雌性配子单独产生胚胎,不论其是否发生成个体都称为孤雌生殖,也叫孤雌激活[1].
-
用同源重组法构建小鼠卵母细胞cDNA酵母双杂交文库的探索
目的 探索卵巢成熟及明确早胚发育过程中,构建小鼠卵母细胞cDNA文库筛选所涉及的相互作用蛋白.方法 利用SMART技术,构建酵母双杂交筛选卵母细胞中与输卵管蛋白相互作用的靶分子成分为目的,构建小鼠卵母细胞cDNA酵母双杂交文库.采用Stratagene RNA prepkit抽提500枚卵母细胞总RNA,应用线性化载体pGADT7-Rec在体构建小鼠卵母细胞cDNA酵母双杂交文库.结果 文库的滴度为3.7×106,重组片段大小主要集中在0.6-0.9 kb,重组率为60%.结论 所构建的小鼠卵母细胞cDNA文库可用于酵母双杂交筛选.
-
pEGFP-P21-WT及pEGFP-P21-S145A融合表达载体在小鼠卵母细胞中的定位
目的 通过构建pEGFP-P21-WT及pEGFP-P21-S145A融合表达载体,确定在小鼠卵母细胞中的定位.方法 采用显微注射方法将融合表达载体导入小鼠卵母细胞中,荧光镜下直接观察P21及突变体的细胞定位.结果 pEGFP-P21-WT注射后,荧光分布集中于核中,而pEGFP-P21-S145A注射后,荧光信号主要分布于胞浆中,对照组(注射pEGFP-C3)荧光信号均匀分布于整个细胞内.结论 P21蛋白145位突变后影响了P21蛋白的细胞定位.
-
骨髓间充质干细胞及其向神经元细胞分化的研究进展
早期的干细胞研究主要集中在骨髓造血干细胞(hematopoietic stem cell,HSC)上.现在发现骨髓中除了造血干细胞以外,还存在一类骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs).BMSCs 是与HSC截然不同的一类干细胞,具有自我更新和多向分化的潜能, 能分化为成骨细胞、脂肪细胞、成肌纤维细胞、软骨细胞、内皮细胞、心肌细胞,神经元样细胞[1-2].在新近的研究中,人们还发现它可以向内胚层及外胚层的细胞分化[3-4],具有很强的可塑性.现有研究指出BMSCs可促进离体培养的小鼠卵母细胞的存活、发育及成熟[5].BMSCs还易被外源基因转染和表达,因而可能是细胞治疗和基因治疗的理想靶细胞[6-8].
-
蛋白激酶B(PKB/AKT)在小鼠卵母细胞减数分裂恢复过程中对CDC25B定位及表达的影响
目的:探讨蛋白激酶B(PKB/AKT)在小鼠卵母细胞减数分裂恢复过程中对CDC25B定位及表达的影响.方法:使用激光共聚焦显微镜观察AKT对CDC25B定位的影响;Western blotting方法检测CDC25B在AKT mRNA显微注射卵母细胞中的表达改变.结果:CDC25B主要位于GV期卵母细胞的细胞核和GVBD期卵母细胞的细胞膜,然而当使用AKT的抑制剂处理卵母细胞时CDC25B的分布一直停留在细胞核;在AKT mRNA显微注射组,CDC25B的表达在GVBD期明显增加.结论:AKT在小鼠卵母细胞减数分裂的恢复过程中可以调节CDC25B的定位及表达.
关键词： 蛋白激酶B (PKB/Akt) 减数分裂 小鼠卵母细胞 -
激光共聚焦显微镜观察小鼠卵母细胞及早期胚胎中微丝的分布
目的:观察微丝在小鼠卵细胞及早期胚胎中的分布情况,为进一步明确微丝在受精卵发育中的作用机制打下基础.方法:采用免疫荧光化学法结合激光共聚焦显微技术对卵细胞的微丝分布进行观察.结果:在小鼠MⅡ期卵母细胞中微丝分布于卵细胞的皮质区,集中在纺锤体处.在小鼠1-细胞期受精卵中微丝集中分布于卵细胞与极体的连接处.在2-细胞期受精卵中的微丝则集中分布在卵细胞的分裂沟处.用松弛素B(CB)解聚小鼠体内受精卵的微丝,细胞形态及分裂受到严重影响.结论:微丝在小鼠卵母细胞及早期胚胎中有着独特的分布,其可能参与多种功能.
关键词： 微丝 小鼠卵母细胞 胚胎 免疫荧光技术 激光扫描共聚焦显微镜(LCSM) -
HIV-1 gag基因经卵母细胞垂直传递模型的建立
目的:建立HIV-1 gag基因经卵母细胞垂直传递的模型,为HIV通过雌性生殖细胞垂直传递的研究奠定实验基础.方法:将含有HIV-1 gag基因的重组质粒pIRES2-EGFP-gag注射到小鼠双侧卵巢,转染生殖细胞.应用超排获得实验用卵母细胞,收集显示绿色荧光的卵母细胞,将一部分呈现绿色荧光的卵母细胞裂解,提取基因组DNA,采用PCR检测gag DNA是否存在卵母细胞中;再将另一部分带有绿色荧光的卵母细胞常规制备中期染色体片,用荧光原位杂交(FISH)技术检测HIV-1 gag基因在成熟卵母细胞染色体上的整合. 结果:转染pIRES2-EGFP-gag后,在荧光显微镜下能够很清楚地看到带有绿色荧光的卵母细胞;PCR结果显示在带有绿色荧光的卵母细胞中可检测到HIV-1 gag基因特异的阳性条带;FISH检测结果显示在卵母细胞的中期染色体上检测到HIV-1 gagDNA的阳性信号.结论:HW-1 gag基因能够通过卵透明带和细胞膜并整合到卵母细胞基因组内,本研究为HIV-1 gag基因可经过雌性生殖细胞垂直传递给子代奠定了实验基础.
关键词： HIV-1 gag基因 垂直传递模型 小鼠卵母细胞
