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应用钙离子载体A23187及6-甲基嘌呤对人卵母细胞进行孤雌激活
目的:观察钙离子载体A23187(Ca-A23187)及6-甲基嘌呤(6-DMAP)对人类卵母细胞的孤雌激活作用.方法:收集体外受精周期中不适于进行卵胞浆内单精子注射的生发泡期或第一次减数分裂中期的不成熟卵母细胞244个在体外培养成熟,其中155个体外成熟卵母细胞按不同激活方案分组:5 μmol/L Ca-A23187组、10 μmol/L Ca-A23187组、对照组、6-DMAP组及Ca-A23187+6-DMAP组.激活处理后12～18 h观察第二极体排出及原核形成情况.结果:5及10 μmol/L Ca-A23187组卵母细胞激活率分别为40.7%(11/27)和37.1%(13/35),较对照组的9.5%(2/21)明显增加(P<0.01);6-DMAP组的激活率,11.5%(3/26)较Ca-A23187+6-DMAP组,58.7%(27/46)明显下降.Ca-A23187激活后卵母细胞主要表现为一原核二极体,而Ca-A23187+6-DMAP激活的卵母细胞以一原核一极体占多数(19/27,70.4%).结论:卵母细胞孤雌激活的发生及原核形成类型与激活方案有关,单独Ca-A23187或与蛋白激酶抑制剂6-DMAP联合应用都能使人类卵母细胞发生孤雌激活,二者联合应用更易于诱导卵母细胞发生孤雌激活.
关键词： 孤雌激活 卵母细胞 人类 钙离子载体A23187 6-甲基嘌呤 -
小鼠慢性连续取卵及孤雌激活后发育
小鼠是生命科学研究中为重要的实验动物之一.许多模型首先在小鼠中建立或只在小鼠中获得成功.例如胚胎干细胞系的建立[1,2],生长素转基因模型[3]以及体细胞克隆治疗模型[4].通常情况下,经过超促排卵处理或未经处理的雌鼠仅在处死后取1次卵.至今还未见到有关在小鼠活体取卵的报道.本研究旨在建立一种可重复从同一个体小鼠收集卵母细胞或受精卵的方法.
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小鼠卵子老化过程中皮质颗粒的变化和自发孤雌激活的研究
目的:通过卵子老化过程中皮质颗粒的变化和自发孤雌激活比例,探讨老化卵子受精异常的原因.方法:对8～10周龄雌鼠注射孕马血清促性腺激素和绒毛膜促性腺激素14h后,于不同时间段取出MⅡ期成熟卵子分作体内不同时间老化组(MⅡ+ 0h、MⅡ+ 6h、MⅡ+ 12h、MⅡ+ 18h)；成熟MⅡ+0h卵子取出后体外分别培养6h、12h、18h作为体外老化组.对各组卵子免疫荧光染色,共聚焦显微镜成像显示染色体形态和皮质颗粒分布.体内各组卵子取出后继续体外培养8h统计自发孤雌激活的比例和碎裂卵子数.结果:体内和体外MⅡ+ 12h、MⅡ+ 18h组自发皮质颗粒排放比例和皮质颗粒内迁数明显高于MⅡ+ 0h、MⅡ+ 6h组.体外MⅡ+ 18h组自发皮质颗粒排放比例和皮质颗粒内迁数低于体内MⅡ+ 18h组.体内MⅡ+ 12h、MⅡ+ 18h组卵子取出继续体外培养8h后孤雌激活比例和死亡比例明显高于体内MⅡ+ 0h和MⅡ+ 6h组.结论:卵子在老化过程中存在皮质颗粒自发排放和皮质颗粒内迁,以及自发孤雌激活和碎裂化,这些因素均可能导致老化卵受精能力的降低.卵子老化过程中皮质颗粒排放和内迁可能受到体内环境的影响.
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小鼠卵母细胞体外成熟培养系统的建立与优化
目的 探讨激素刺激时间、体外培养时间对小鼠卵母细胞核成熟及不同激活方案对卵母细胞孤雌激活、胚胎发育能力的影响.方法 孕马血清促性腺激素(PMSG)超排处理,在体外培养的不同时间点检测卵母细胞核成熟率(每个处理至少重复3次,3只/重复,以下实验相同).分别采用乙醇结合6-二甲氨基嘌呤(6-DMAP)法和SrCl2法激活卵母细胞,胚胎培养液选用CZB[胎牛血清(FBS)或牛血清清蛋白(BSA)]两种,确定佳激活方案.对不同时间点成熟的卵母细胞进行激活,确定佳激活卵龄.研究缩短PMSG刺激时间对卵母细胞发育的影响.结果 将PMSG刺激时间从46h缩短至24h,卵母细胞获得高核成熟率(97.6％ vs 91.9％)的培养时间由14h延长至16h;缩短PMSG刺激时间,核成熟率不受影响,但能显著降低激活率(91.2％ vs37.1％)和囊胚率(20.9％ vs0.0％).两种方法体内成熟卵母细胞激活率均高于90％,但囊胚率差异显著(P＜0.05).卵母细胞体外培养至24～26h时,激活率(89.5％)和囊胚率(21.9％)均达到高点.结论 建立了一种小鼠卵母细胞体外成熟培养系统,即PMSG超排处理46h、卵母细胞培养24h,CZB(10mmol/L SrCl2)激活2.5h后采用CZB (0.5％ BSA)进行胚胎培养.
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不同激活方法对小鼠卵母细胞孤雌激活胚胎发育的影响
目的 观察不同激活方法对小鼠卵母细胞激活的影响,以优化核移植的小鼠卵母细胞激活方案.方法 昆明种小鼠经腹腔注射7.5～10U孕马血清促性腺激素(PMSG),48h后腹腔注射同样剂量的人绒毛膜促性腺激素(hCG).注射hCG后14～16h收集卵母细胞,18h后用单个激活剂激活卵母细胞.单个激活剂包括钙离子载体(A23187,5μmol/L,5min)、乙醇(Eth,7%,7min)、氯化锶(SrCl2,10mmol/L,20min).结果 单个激活剂激活小鼠卵母细胞时,卵裂率同其他组(48%～70%)相比,SrCl2组高(72%).囊胚发育率(9%～20%)均高于对照组(1%,P＜0.05),且SrCl2组囊胚率(20%)高于A23187组(9%)和乙醇组(12%,P＜0.05).单个激活剂同蛋白激酶抑制剂6-二甲氨基嘌呤(6-DMAP)联合使用能使卵母细胞获得完全的激活.乙醇+6-DMAP组(95%和35%)和SrCl2+6-DMAP组(92%和31%)卵裂率和囊胚形成率明显高于其他各组(49%～53%和3%～17%,P＜0.05),两组间没有差异.A23187+6-DMAP组的囊胚率(17%)与对照组(3%)有显著性差异(P＜0.05).本文还比较了6-DMAP在不同浓度(0.2mmol/L和2.5mmol/L)以及不同激活时间(1.5h和3.5h)与单个激活剂(乙醇或SrCl2)组合对小鼠卵母细胞激活的影响.在高浓度(2.5mmol/L)短时间(1.5h)的6-DMAP组合组囊胚率(34%～36%对3～23%,P＜0.05)和卵裂率较高.结论 乙醇和SrCl2与6-DMAP组合,均能较好地激活小鼠卵母细胞,组合中乙醇组合优于SrCl2.此外,6-DMAP的浓度和激活时间也是影响激活效率的重要因素.单个化学激活剂不能完全激活小鼠卵母细胞.
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水牛卵母细胞孤雌激活及孤雌胚与体外受精胚发育的比较
目的对MⅡ期水牛卵母细胞进行人工诱导激活,可以间接判断体外成熟卵母细胞质量的优劣,并且,卵母细胞的充分激活也是提高核移植效率的关键因素之一.比较了水牛卵母细胞体外成熟时间对孤雌激活胚发育能力的影响以及不同化学激活方法对水牛卵母细胞孤雌激活效果的影响,并在相同条件下,对孤雌激活胚与体外受精胚的发育能力进行了比较.结果表明,水牛卵母细胞体外成熟27h或30 h的囊胚发育率(19.0%,17.7%)明显高于体外成熟21 h或24 h的囊胚发育率(12.3%,13.8%);Ion联合6-DMAP激活水牛卵母细胞的效果优于其他几组激活方法;在相同培养条件下,孤雌激活胚与体外受精胚的发育能力存在着差异,其中卵裂率差异不显著,但孤雌激活胚的囊胚发育率显著高于体外受精胚(21.7%,13.0%).
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电融合仪BLS在猪卵母细胞孤雌激活中的应用
目的 建立并优化BLS细胞融合仪在猪孤雌胚体外生产中的使用条件,同时为克隆胚的生产提供数据参考.方法 以体外成熟的猪卵母细胞为研究对象,研究了不同的电场强度、脉冲时程和脉冲次数对猪卵母细胞电激活效果及其对孤雌胚发育率的影响.结果 电激参数(1.2 kV/cm、100 μs、2次脉冲)能够得到较高的卵裂率和囊胚率(70%、30%左右);BLS细胞融合仪是一种经济高效的胚胎激活仪.
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不同激活方法对小鼠卵母细胞孤雌激活的实验观察
目的建立合适的小鼠卵母细胞孤雌激活方法.方法取不同卵龄小鼠卵母细胞,运用不同浓度的氯化锶和不同强度的电脉冲对其进行活化,观察小鼠卵母细胞激活率和体外发育状况.结果①14、16和18 h卵龄组卵母细胞经10 mmol/L SrCl2处理后,三组的激活率随卵龄的增长而提高,分别为21.1%、41.8%和73.7%,组间差异有统计学意义(P＜0.05);卵母细胞离体后在激活前体外培养3 h也能提高其激活率,但当卵龄达到一定时(18h),体外培养激活率不再提高.②5.0、10.0、15.0 mmol/L三种浓度的SrCl2均能有效地激活小鼠卵母细胞,激活率分别为58.5%、68.95和70.9%,与对照组和1.6 mmol/L组相比差异有统计学意义(P＜0.05).③卵母细胞的激活率随处理时间的延长而提高,30、60、120、240 min SrCl2处理时间的激活率分别为44.9%、56.1%、68.9%、77.0%,相隔两组之间差异有统计学意义(P＜0.05).④1.5 kV/cm,160μs和1.0 kV/cm,320μs脉冲刺激下的卵母细胞激活率显著高于1.8 kv/cm,90μs脉冲刺激组(58.5%vs27.1%、69.1%vs27.1%,P＜0.05),前两组之间差异无统计学意义(P＞0.05).结论小鼠卵母细胞孤雌激活率与卵龄和激活方案有关;氯化锶浓度、作用时间和电脉冲强度对小鼠卵母细胞的活化有明显影响.
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孤雌生殖技术的研究进展
孤雌生殖技术是无性生殖技术的一种,可以实现无需精子介入的卵母细胞激活分裂和发育,对间接评估卵母细胞的质量、分析早期胚胎发育中父系母系配子相互作用、研究胚胎发育初始机制具有非常重要的意义,同时孤雌生殖技术对建立胚胎干细胞系有重要的作用,是近年来生殖生物学研究的热点之一.但孤雌生殖技术在某些国家和地区还受到宗教、道德、伦理的制约,开展广泛的科学研究还存在一定难度.对孤雌生殖研究现状及存在问题做综述.
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小鼠孤雌激活胚胎细胞因子分泌水平研究现状
孤雌激活是指MII期卵母细胞通过人工刺激(化学或物理等方法)激活,完成第二次的减数分裂、卵裂从而形成早期胚胎.此过程不需精子刺激,故也叫孤雌生殖.近年来,孤雌生殖技术是生殖生物学研究的热点之一,是一种无性生殖技术,在创建胚胎干细胞系方面有重要的作用.在遗传学研究中,因小鼠与人类的遗传学背景相似,故常被用作哺乳类实验动物.本综述即是关于小鼠孤雌激活胚胎细胞因子分泌水平的研究.
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促排卵药物对小鼠卵母细胞孤雌激活质量的影响
目的:探讨适宜的促排卵药物及佳的促排卵剂量,优化激活方法,为小鼠孤雌激活的研究提供较规范的促排卵方法与数据.方法:采用尿促性腺激素(HMG)与孕马血清促性腺激素(PMSG)以及不同剂量促排卵,比较对CD-1(R)小鼠卵母细胞孤雌激活质量的影响.结果:HMG促排卵方法中,10IU的囊胚形成率具有明显优势,囊胚孵出率有显著差异(P<0.05);5IU获卵母细胞(MⅡ)率较低(P<0.05),其它指标无优势;15IU超速卵裂率较高(P<0.05).PMSG促排卵也显示类似的结果.两种方法中HMG获得了较高的囊胚形成率、囊胚孵出率,与PMSG比较差异均有统计学意义(P<0.05).结论:①HMG 10IU促排卵方法对小鼠卵母细胞孤雌激活的囊胚形成率、囊胚孵出率等方面均有明显优势,剂量过少或过多均有可能影响卵母细胞(M Ⅱ)的质量.②HMG成分恒定、剂量准确,在孤雌激活中应用效果较好.
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不同卵龄对小鼠卵母细胞孤雌激活的影响
孤雌生殖一词早是由Oven于1849年提出,所谓孤雌生殖是通过人工刺激模拟受精过程,使卵母细胞在无精子条件下被激活,即无雄性配子的任何作用,由雌性配子产生胚胎,不论其是否发育成个体均称为孤雌生殖,又称为孤雌激活[1].
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不同培养基对小鼠卵母细胞孤雌激活的影响
孤雌生殖(parthenogenesis)又称单性生殖,是一种生物学现象.是指没有雄性配子参与,而仅通过单个卵母细胞产生新个体的繁殖技术.后又被重新定义为在没有任何雄性配子的作用下,由雌性配子单独产生胚胎,不论其是否发生成个体都称为孤雌生殖,也叫孤雌激活[1].
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小鼠孤雌胚胎干细胞系的建立及生物学特性鉴定
目的:探讨建立合适的小鼠孤雌胚胎干细胞建系方法.方法:采用氯化锶联合细胞松弛素B激活B6D2F1杂交小鼠卵母细胞,所获得的囊胚与桑椹胚分别用于孤雌胚胎干细胞的建系,观察两者的建系成功率.结果:共建立了12株小鼠孤雌胚胎干细胞系,这些细胞SSEA-1抗原阳性,SSEA-4,TRA-1-81,TRA-1-60表面抗原阴性,具有AKP活性,保持正常染色体核型,体内外分化分别形成畸胎瘤和拟胚体.结论:采用囊胚和去透明带的桑葚胚建立孤雌胚胎干细胞系获得成功.该方法为人类纯合子的胚胎干细胞建系提供基础,在自体细胞治疗领域中具有潜在的应用价值.
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老化对卵母细胞孤雌发育和减数分裂期间微管动态变化的影响
目的 研究老化对卵母细胞孤雌激活发育率的影响,以及老化对减数分裂期间微管的动态变化的影响.方法 用孤雌激活的方法来观察不同老化时间胚胎的发育情况;用免疫荧光化学与激光共聚焦显微术结合的方法研究小鼠卵母细胞微管的动态变化.结果 从注射hCG后14h到18h,卵母细胞在体外老化过程中激活率和发育率呈上升趋势,但是差异不显著.体外老化至18h,卵母细胞更容易被激活,并且减数分裂期间微管的变化发生要早于14h.结论 短时间的体外老化可以使细胞更容易被激活,且微管发育更完善.
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孤雌激活与人类辅助生殖技术
人类辅助生殖技术经常剩存大量卵泡,这些卵泡过完保存期限后多数遗弃.将不孕不育患者胚胎移植后所剩的卵泡进行孤雌激活,所得的孤雌囊胚无法发育成新的个体,这使得制取的孤雌干细胞在既不违背医学伦理同时,又具有类似于胚胎干细胞的全能性,可用于再生医学等领域.目前文献报道已经有多种实验方案能激活人和实验动物的卵母细胞,制取孤雌胚胎干细胞.本综述主要探讨在经捐赠者同意后,将临床所剩的卵母细胞进行孤雌激活制取孤雌干细胞,用于再生医学领域的潜在可能性.
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化学剂法对兔卵母细胞孤雌激活的效果
目的 研究钙离子载体A23187和6-二甲基氨基嘌呤(6-DMAP)及3种酶对兔卵母细胞的激活率,并观察其体外发育情况.方法 兔超排后获得卵母细胞,经脱颗粒处理后用A23187和6-DMAP处理不同时间,体外培养5～7 d,观察细胞发育与囊胚形成情况.结果 钙离子载体A23187激活处理5 min后, 继续在2.0 mmol/L 6-DMAP中分别处理3.5、4.0、4.5、5.0 h,均能激活兔卵母细胞;以处理4.0 h的卵裂率高(58.82%,20/34),并有15%(3/20)的囊胚发育率.透明质酸酶、胶原酶和胰酶处理20 min后, 均能激活兔卵母细胞,其中透明质酸酶处理20 min的激活率和卵裂率高,分别为58.33%(28/48)和63.64%(28/44).结论 兔卵母细胞孤雌激活率与激活方法密切相关.化学激活剂的处理时间及消化酶的不同均对兔卵母细胞的激活产生显著影响.
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小鼠孤雌胚早期发育过程中γ-微管蛋白的动态变化
微管蛋白是构成微管的主要蛋白,其中a、β亚单位形成异二聚体,而γ-微管蛋白在微管组装中起作用.为了研究小鼠早期孤雌胚中γ-微管蛋门的动态变化,本实验采用了免疫荧光化学染色与激光共聚焦显微镜观察相结合的方法,在SrCl2激活的卵母细胞减数分裂以及早期孤雌胚有丝分裂过程中对γ-微管蛋白进行了定位观察.结果显示,SrCl2和细胞松弛素B(cytochalasin B,CB)诱导的第二次减数分裂中期(metaphase Ⅱ of meiosis,MII)小鼠卵母细胞恢复减数分裂,并且纺锤体始终与质膜平行,表明纺锤体旋转被抑制,但核分裂不受影响.减数分裂过程中γ-微管蛋F1主要定位于中期纺锤体两极和后期分开的染色单体之间:孤雌活化两雌原核形成以后,γ-微管蛋白聚集在两雌原核周围.在早期孤雌胚有丝分裂间期无定形的γ-微管蛋白均匀分布于核;前中期γ-微管蛋白向两极移动,遍布于整个纺锤体区.有丝分裂中期、后期和末期γ-微管蛋白的分布变化与减数分裂相似.结粜表明,SrCl2和CB激活的MII卵母细胞产牛杂合二倍体;γ-微管蛋白具有促微管负极帽形成和稳定微管的功能,从而促进纺锤体的形成;分裂后期和木期γ-微管蛋白的重新分布可能足由纺锤体牵引同源染色体分离所诱导的;γ-微管蛋白负责两雌原核的迁移靠近.
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钙离子载体A23187联合嘌呤霉素对人体外成熟卵母细胞孤雌激活作用的研究
目的:探讨钙离子载体A23187或联合嘌呤霉素(puromycin)对人类体外成熟卵母细胞的孤雌激活作用.方法:收集体外培养成熟的人卵母细胞124枚,根据体外成熟培养的时间分为24、48、72 h组.分别采用A23187、A23187联合嘌呤霉素进行孤雌激活,然后应用荧光原位杂交(FISH)技术对孤雌胚胎进行性染色体分析.结果:A23187或联合嘌呤霉素能激活体外成熟的卵母细胞,激活率分别为38.9%、71.8%;二者联合应用能有效地提高孤雌胚胎的发育潜能.随着体外成熟培养的时间延长,A23187联合嘌呤霉素对卵母细胞激活率呈下降趋势;其中24、48 h组成熟的卵母细胞激活率和胚胎发育潜能显高于72 h组.FISH对9个孤雌胚胎的性染色体分析示,7个孤雌胚胎为XX,2个为X.结论:钙离子载体A23187联合嘌呤霉素能有效地激活人体外成熟卵母细胞,形成的孤雌胚胎核型多数为双倍体.
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兔卵母细胞孤雌激活及不同添加物对激活胚胎发育的影响
目的 探寻一种稳定有效的卵母细胞激活方法及体外培养体系,为下一步的治疗性克隆胚激活及培养实验提供相关参照. 方法 (1)选取具有第一极体的成熟兔卵母细胞随机分组,比较1.2 kV/cm、1.6 kV/cm、2.0 kV/cm场强的电激活及5μg/mL离子霉素(ION)激活对兔卵母细胞孤雌激活效果；(2)激活处理后的卵母细胞,分别在添加0、10、20、40、80 ng/mL白血病抑制因子(LIF)及添加0、1×、2×胰岛素、转铁蛋白、硒化钠复合物(ITS)的M199液中培养,比较孤雌胚胎的卵裂率、8-16细胞胚胎比例、桑囊率以及囊胚细胞总数情况. 结果 (1)不同激活方式对兔卵母细胞的激活效果差异较大.ION处理组存活率高于2.0 kV/cm电激活处理组,差异有统计学意义(P＜0.05)；而在分裂率、8-16细胞率、桑囊率上,ION处理组高于1.2 kV/cm电激活处理组,差异有统计学意义(P＜0.05).(2) 20 ng/mL LIF组桑囊率高于80 ng/mL LIF组,差异有统计学意义(P＜0.05).在囊胚细胞总数上,20 ng/mL LIF组高于40 ng/mL LIF和80 ng/mL LIF组,差异有统计学意义(P＜0.05).1×ITS组的桑囊率高于2×ITS组,差异有统计学意义(P＜0.05).此外,0×ITS组及1×ITS组的囊胚细胞总数分别为166.00枚、147.40枚,多于2×ITS组(78.00枚),差异有统计学意义(P＜0.05). 结论 ION处理激活新西兰大白兔卵母细胞能获得较好的分裂率和囊胚率；添加20 ng/mL LIF、1 ×ITS可以促进兔孤雌激活胚胎的后期发育.
