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卵母细胞的细胞质体外成熟的观察指标
卵母细胞体外成熟(IVM)培养过程中还存在很多问题,胞核和胞质成熟的不同步直接影响了卵母细胞的发育能力,从而影响了IVM的成功率.在探讨人未成熟卵母细胞IVM的各种影响因素时,对细胞质成熟一直缺乏有效的观察、评价指标,从而影响了研究进程.本文就IVM中卵母细胞成熟胞质的一般形态、超微结构以及可能影响胞质成熟的特异性表达基因做简要综述.
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钙对人卵母细胞皮质颗粒排放的调节及与经典型蛋白激酶C关系
目的探讨经药物处理人卵母细胞,钙引起人卵母细胞皮质颗粒排放的机制.方法分别用蛋白激酶C(PKC)激活剂、抑制剂及钙离子载体处理人卵母细胞,使用激光共聚焦扫描显微镜观察PKC的转位及皮质颗粒的排放.结果使用PKC激活剂处理后,卵母细胞出现了明显的PKCα和γ的转位,但未观察到皮质颗粒的排放.钙离子载体A23187可以引起明显的皮质颗粒的排放,但未出现PKC的转位. 结论PKC不介导人卵母细胞内钙离子升高引起的皮质颗粒的释放放.
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小鼠卵子老化过程中皮质颗粒的变化和自发孤雌激活的研究
目的:通过卵子老化过程中皮质颗粒的变化和自发孤雌激活比例,探讨老化卵子受精异常的原因.方法:对8～10周龄雌鼠注射孕马血清促性腺激素和绒毛膜促性腺激素14h后,于不同时间段取出MⅡ期成熟卵子分作体内不同时间老化组(MⅡ+ 0h、MⅡ+ 6h、MⅡ+ 12h、MⅡ+ 18h)；成熟MⅡ+0h卵子取出后体外分别培养6h、12h、18h作为体外老化组.对各组卵子免疫荧光染色,共聚焦显微镜成像显示染色体形态和皮质颗粒分布.体内各组卵子取出后继续体外培养8h统计自发孤雌激活的比例和碎裂卵子数.结果:体内和体外MⅡ+ 12h、MⅡ+ 18h组自发皮质颗粒排放比例和皮质颗粒内迁数明显高于MⅡ+ 0h、MⅡ+ 6h组.体外MⅡ+ 18h组自发皮质颗粒排放比例和皮质颗粒内迁数低于体内MⅡ+ 18h组.体内MⅡ+ 12h、MⅡ+ 18h组卵子取出继续体外培养8h后孤雌激活比例和死亡比例明显高于体内MⅡ+ 0h和MⅡ+ 6h组.结论:卵子在老化过程中存在皮质颗粒自发排放和皮质颗粒内迁,以及自发孤雌激活和碎裂化,这些因素均可能导致老化卵受精能力的降低.卵子老化过程中皮质颗粒排放和内迁可能受到体内环境的影响.
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猪卵巢卵母细胞体外成熟及体外受精过程中皮质颗粒变化的研究
目的研究猪皮质颗粒在体外成熟及体外受精过程中的变化,以及皮质颗粒与多精受精的关系. 方法用异硫氰荧光素联接的花生四烯酸(FITC-PNA)标记体外成熟不同时间及体外受精不同时间皮质颗粒. 结果皮质颗粒在猪卵母细胞体外成熟过程中逐渐由皮质部向卵质膜下迁移,并在质膜下排布成单层.体外成熟过程中所排出的第1极体也被FITC-PNA所标记,说明第1极体中含有皮质颗粒.在对不同体外成熟时间的卵母细胞进行授精时发现,皮质颗粒的释放速度与体外成熟时间呈正比例关系.为进一步证实皮质颗粒的排放速度与多精受精之间的关系,还进行了精子穿透实验.结果显示,体外成熟48h的卵母细胞其多精受精率为73%,比体外成熟36h(83%)、24h(80%)的卵母细胞要低.并且进入卵子的精子数目(1.7)比后两者(分别为3.1和2.9)的少. 结论多精受精率与皮质颗粒释放的速度和数量的大小有关.
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影响高龄小鼠卵母细胞质量的超微结构因素
目的 探讨高龄小鼠卵母细胞线粒体、皮质颗粒、微丝、纺锤体及染色体形态和排布的变化规律.方法 将雌性昆明小鼠分为年轻组(4～8周)和高龄组(48 ～ 52周).腹腔内注射孕马血清促性腺激素(PMSG) 10IU/只行促排卵,48 h后腹腔内注射人绒毛膜促性腺激素(hCG)10 IU/只,14 h后收集输卵管的卵冠丘复合物(OCCC).脱去颗粒细胞,获取成熟卵母细胞(MⅡ期)经2％多聚甲醛固定.抗小鼠α-tubulin单克隆抗体染色卵母细胞纺锤体的微管,罗丹明标记的鬼笔环肽染色微丝,FITC结合的小扁豆凝集素染色皮质颗粒,Mito TrackerGreen FM染色线粒体.激光扫描共焦显微镜下观察.结果 共获取小鼠卵母细胞372枚,其中年轻组179枚,高龄组193枚.高龄组小鼠卵母细胞纺锤体异常率(71.78％±1.27％)、染色体排列异常率(65.16％±1.52％)明显高于年轻组(18.93％±1.27％,32.24％±1.10％)(P＜0.01,P＜0.01);高龄组小鼠卵母细胞线粒体的荧光强度(28.09±6.62)明显低于年轻组(45.07±5.90) (P ＜0.01);高龄组小鼠成熟皮质颗粒(Ⅲ级皮质颗粒)(51.00％±1.00％)明显低于年轻组(94.04％±0.71％)(P＜0.01).结论 高龄小鼠卵母细胞中各主要细胞器、细胞骨架及染色体排列异常率明显增加,可能是导致高龄受孕率低的重要原因.
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皮质颗粒在评估卵母细胞胞质成熟中的相关应用
卵母细胞的成熟包括细胞核和胞质的成熟.目前无公认标准对卵母细胞胞质成熟度进行评估.皮质颗粒的增殖和特征性分布是常用于评估卵母细胞胞质成熟的重要指标.本文主要对皮质颗粒评估卵母细胞胞质成熟度的可行性和相关应用作一综述.
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干细胞条件培养液促进小鼠卵母细胞体外成熟
目的:研究骨髓间充质干细胞(MSCs)条件培养液对小鼠未成熟卵母细胞体外成熟的作用.方法:分离、培养小鼠MSCs,获得MSCs条件培养液.收集3类生发泡期卵母细胞,分别在对照培养基和条件培养液中培养,观察卵母细胞成熟率,判断佳时间点；FDA、Hoechst33258和PI联合染色评价细胞活力；荧光标记检测皮质颗粒分布、迁移及纺锤体复合物的形成情况.结果:条件培养液组3类生发泡期卵母细胞的成熟率高于对照培养基组；其中,完全/大部分裸露的生发泡卵母细胞和周围有疏松的颗粒细胞包裹的生发泡卵母细胞的佳体外成熟时间为16h,有完整的数层颗粒细胞紧密包裹的生发泡卵母细胞的佳体外成熟时间为24 h.体外成熟卵母细胞活力良好,皮质颗粒分布及纺锤体复合物形成与体内成熟卵母细胞一致.结论:MSCs条件培养液有利于小鼠体外成熟卵母细胞核、细胞质同步成熟,提高卵母细胞质量,是一种较好的体外成熟培养体系.
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受精前后地鼠卵母细胞皮质颗粒的变化
为观察人精子与地鼠卵异体受精前后,卵母细胞内皮质颗粒的变化,采用罗丹明偶联的兵豆凝集素标记受精前、受精30 min和3 h后金黄地鼠的去透明带卵母细胞,用激光共聚焦显微镜观察皮质颗粒的分布情况,结果显示,受精前卵母细胞内的皮质颗粒散在于卵质膜下和皮质区,受精后皮质颗粒数量减少,并发生边集.说明人精子与金黄地鼠卵异体受精时,可引起皮质颗粒向卵质膜靠拢并胞吐.
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体外受精中皮质颗粒与多精受精的相关性
目的 通过观察小鼠及人不同受精状态时皮质颗粒(CG)的分布情况及分级，找出体外受精(XVF)中CG与多精受精的相关性，以期指导IVF的临床工作。方法 选择小鼠不同成熟时期及小鼠和人不同受精状态的卵母细胞，经荧光标记后分别观察CG的分布和迁移情况。结果 小鼠2PN的卵母细胞中92％的CG分布为Ⅲ级，3PN的卵母细胞中8％的CG分布为Ⅲ级；人2PN的卵母细胞中100.％的CG分布为Ⅲ级，3PN的卵母细胞中17.6％的CG分布为Ⅲ级；小鼠卵母细胞成熟后，体外培养时间分别延长到48和60 h，CGⅢ级所占比例分别降至73.3％和20.0％，同时体外受精的3PN率逐渐增加到10.0％和16.7％。结论 3PN卵母细胞中CG释放不完全，因而不能阻止多精受精；过熟或老化的卵母细胞，CGⅢ级所占比例下降，而3PN率上升；证实了小鼠及人IVF中CG与多精受精具有明显的相关性。
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小鼠体外发育与体内发育成熟卵子胞浆成熟度和细胞骨架比较
[目的]体外培养小鼠窦前卵泡得到成熟卵子,比较其与体内发育成熟卵子直径、谷胱甘肽含量、皮质颗粒分布以及纺锤体结构的差异,评估胞浆成熟度对卵子发育潜能的影响.[方法]选择出生10 d小鼠,分离窦前卵泡,培养后得到326个M Ⅱ期卵子作为体外发育组.8～10周雌鼠经孕马血清和绒毛膜促性腺激素注射得到244个M Ⅱ卵子作为体内发育组.酶法检测卵子谷胱甘肽含量,免疫荧光染色,共聚焦显微镜成像显示纺锤体形态和皮质颗粒分布.[结果]体外发育成熟卵子直径(69.6±5.7)μm,明显小于体内发育成熟卵子直径(84.2±3.0)μm;体外发育成熟卵子谷胱甘肽含量(4.3±0.7)pmol明显低于体内发育成熟卵子(6.1±1.0)pmol;50个体外发育成熟卵子中18个(36%)皮质颗粒周边分布,40个体内发育成熟卵子中36个(90%)皮质颗粒周边分布(P＜0.05);14个(28%)体外发育卵子出现无皮质颗粒区,34个(85%)体内发育成熟卵子出现无皮质颗粒区(P＜0.05);120个体外发育成熟卵子中46个(38.3%)显示正常桶状纺锤体,84个体内发育成熟卵子中80个(95.2%)显示正常桶状纺锤体(P＜0.05).[结论]体外发育成熟卵子胞浆成熟度没有达到体内发育成熟卵子水平.
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抑制素A及促性腺激素对小鼠未成熟卵母细胞体外成熟的影响
目的:探讨抑制素A(Inhibin A,INH A)对小鼠未成熟卵母细胞体外成熟(In vitro maturation,IVM)的影响.方法:从孕马血清促性腺激素(Pregnant mare serum gonadotrophin,PMSG)组(使用PMSG组,16例)及无PMSG组(未使用PMSG组,20例)获得的生殖泡期(Germinal vesele,Gv)卵母细胞在不同浓度INH A的培养液中进行体外培养,观察第一极体(The first polar body,PBI)排出和皮质颗粒(Cortical granules,CG)染色情况.结果:PMSG组获卵数为(17.2±2.6)个/只,无PMSG组获卵数为(15.9±1.8)个/只(P>0.05);PMSG组与无PMSG组的PBI率分别为57.7%、50.7%(P＞0.05).PMSG组中INH A 200、350 ng/ml组的PBI率较对照组高(P<0.05);无PMSG组中各INHA组PB1率与对照组比较无显著差异(P＞0.05);结论:INHA和PMSG对体外培养GV期卵母细胞核成熟有促进作用.
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以皮质颗粒评估卵母细胞胞质成熟度在体外受精技术中的应用
目的:通过皮质颗粒(CG)评估卵母细胞胞质成熟度,找出常规体外受精(IVF)周期受精率低或受精失败的可能原因.方法:选择小鼠不同成熟时期及不同受精状态的卵母细胞、人未受精及不同受精状态的卵母细胞,经荧光标记后分别观察CG分布、迁移情况.结果:随着卵母细胞的成熟,CG逐渐从皮质部向质膜下迁移,M Ⅱ期的卵母细胞CG大多已经完成迁移;M Ⅱ期阻滞时间较长者,其2PN率明显高于阻滞时间较短的卵母细胞,而OPN率和3PN率则明显低;MⅡ期阻滞时间长的卵母细胞胞质成熟度明显高于阻滞时间较短的.结论:CG的排放和分布与卵母细胞的成熟度有着直接的关系,其特征性分布可用于评价卵母细胞胞质成熟度,应用于临床工作中.
关键词： 体外受精.胚胎移植(IVF-ET) 皮质颗粒 胞质成熟 受精失败 -
皮质颗粒在评估高龄妇女体外受精中受精失败卵母细胞胞质成熟度作用的研究
目的:探讨CG在评估高龄妇女体外受精中卵母细胞胞质成熟度的作用.方法:52对受精率≤70%的不孕症夫妇分为3组:＜30岁(n=25例);30-34岁(n=11例);≥35岁(n=16例),观察3组体外受精(IVF)周期中受精失败和不同受精状态卵母细胞CG的分布和迁移情况.结果:GV卵母细胞100%CG分布为Ⅰ级;MⅠ期卵母细胞29.2%CG为Ⅱ级,12.5%CG为Ⅲ级;MⅡ期卵母细胞CG Ⅱ级达到42%,Ⅲ级达到20%;年龄≥35岁组CG标记为Ⅲ级的仅为13.3%,与前两组相比差异有统计学意义;同时两原核(2PN)与3PN卵母细胞CG Ⅲ级分布比较,差异亦有统计学意义.结论:CG的特征性分布可用于评价卵母细胞细胞质成熟度;高龄妇女卵母细胞胞质不成熟影响卵母细胞正常受精,这可能是高龄妇女IVF妊娠率低的一个重要原因.
关键词： 体外受精-胚胎移植(IVF-ET) 皮质颗粒 胞核成熟 胞质成熟 受精失败 -
体内外成熟过程中小鼠卵母细胞纺锤体形态和皮质颗粒分布的比较
目的:了解体内外成熟过程中小鼠卵母细胞减数分裂进程、纺锤体形态、皮质颗粒分布的差异.方法:分别收集体内和体外成熟2h、4h、8h,16h的卵母细胞,用免疫荧光法标记微管,Hoclaest33258标记染色体,FITC-LCA标记皮质颗粒,分别观察卵母细胞减数分裂进程、纺锤体形态和皮质颗粒分布,并进行比较.结果:与体外成熟卵母细胞相比,体内成熟的卵母细胞减数分裂进程高度一致.体内成熟的卵母细胞减数分裂中期的纺锤体呈两端逐渐变细的"纺锤状",且靠近卵膜(100%);而大多数体外成熟的卵母细胞的纺锤体两端宽大,呈"桶状",在第一次减数分裂中期和第二次减数分裂中期各有34.29%和43.24%靠近卵膜.体外成熟卵母细胞在第一次减数分裂中期和第二次减数分裂中期出现无皮质颗粒区的比例(分别为12.5%和75%)明显低于体内成熟卵(均为100%).结论:体内和体外成熟的卵母细胞在减数分裂进程、纺锤体的形态和运动、皮质颗粒分布等方面均存在巨大的差异.体外成熟的卵母细胞在这些方面的变化可能与其发育能力下降有关.
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经皮染毒巯基乙酸对昆明小鼠排卵及体内卵母细胞成熟的影响
背景与目的:探讨巯基乙酸(thioglycolic acid,TGA)对昆明小鼠排卵以及卵母细胞体内成熟的影响. 材料与方法:选取昆明小鼠12只,按体重随机分成4组,每组3只,分别为对照组和TGA高(151.25 mg/kg)、中(75.625 mg/kg)、低(37.812 5 mg/kg)3个剂量组.给小鼠皮肤染毒TGA的同时腹腔注射10 IU人绒毛膜促性腺激素(hCG),14 h后,处死小鼠收集卵母细胞进行小鼠排卵计数,采用免疫荧光染色法观察成熟卵母细胞内纺锤体与皮质颗粒(conical germinal,CG)的分布. 结果:TGA高、中剂量组排卵数明显低于对照组及低剂量组(P<0.01及P<0.05);对照组和低剂量组小鼠卵母细胞纺锤体呈双极状,中、高剂量组纺锤体逐渐呈桶状,形态发生了明显改变,且随着TGA剂量的增加,纺锤体的面积有增加趋势;TGA对cG的膜下分布以及无皮质颗粒区(cortical germinal freedomain,CGFD)的形成在形态上没有明显影响.结论:经皮肤给TGA能抑制小鼠排卵,并对卵母细胞成熟有一定影响.
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巯基乙酸对小鼠成熟卵母细胞皮质颗粒分布和MAPK活性的影响
背景与目的:探讨巯基乙酸(thioglycolic acid ,TGA)对小鼠卵母细胞胞浆成熟和相关生化指标的影响.材料与方法:以不同浓度TGA(0.2、1.0、2.5 mmol/L)体外培养小鼠卵母细胞,并设M16培养液对照组,培养16 h后在体视显微镜下,观测卵母细胞生发泡破裂和第一极体排出情况,用免疫荧光染色方法对皮质颗粒(cortical granules,CGs)进行标记,采用western blot方法对p44/42MAPK进行检测.结果:各组生发泡破裂率均达到90%左右,各组间差异无统计学意义(P＞0.05).随着TGA剂量的增加,第一极体排出率下降,各剂量组和对照组相比差异均有统计学意义(P＜0.05).各剂量组均可观察到CGs在细胞膜下的线状排列,但随着TGA吼剂量的增加,质膜下CGs的密度降低,胞浆中CGs的密度有增加的趋势.对照组卵母细胞中有非常明显的无皮质颗粒区(cortical granules free domain,CGFD)形成,0.2 mmol/L组也形成了CGFD,但1.0 matol/L和2.5 mmol/L两个剂量组未观察到CGFD.1.0 mmol/L和2.5mmol/L TGA可抑制p44/42MAPK的活化.结论:TGA可影响小鼠卵母细胞细胞质成熟和MAPK的活性,具有一定的生殖毒性.
