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用低形态学评分D3胚胎建立人胚胎干细胞系
目的 寻找人胚胎干细胞(hESC)建系材料来源.方法 选用IVF低形态学评分的D3胚胎行序贯囊胚培养,用免疫外科的方法去除滋养细胞,将得到的内细胞团(ICM)接种于丝裂霉素C灭活的小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)上培养5～8 d,每4～7 d传代1次,分别取不同代的hESC进行碱性磷酸酶(AKP)染色、转录因子OCT-4、阶段特异性胚胎抗原(SSEA)SSEA-4、SSEA-1、肿瘤排斥抗原(TRA)TRA-1-60、TAR-1-81、核型及体内外分化全能性鉴定.结果 130枚废弃的D3低形态学评分(评分＜16)的胚胎培养出囊胚19枚,获得原代克隆5个,成功培养出两株hESC系,它们具有hESC的共同的生物学特性.结论 部分低形态学评分的D3废弃胚胎可发育成囊胚.囊胚形成率与形态学评分相关,这些胚胎可作为建立hESC系的材料来源之一.
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昆明小鼠3.5d和4d囊胚不同分离方法的比较
背景:远交系的昆明小鼠作为中国自然科学研究主要实验动物,其胚胎干细胞建系的成功率一直很低.目的:探讨昆明小鼠胚胎干细胞体外分离培养的佳方法和适合的采胚时间.方法:采集孕3.5 d和4 d的囊胚分别以免疫外科法和全胚培养法在小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上分离和克隆昆明小鼠胚胎干细胞集落.结果与结论:免疫外科法和全胚法培养3.5 d囊胚的内细胞团贴壁率和原代克隆形成率差异均不显著(P > 0.05);全胚法培养4 d囊胚的内细胞团贴壁率显著高于免疫外科法(P < 0.05),但原代克隆形成率显著低于免疫外科法(P < 0.05);全胚法培养4 d囊胚的原代克隆形成率显著高于3.5 d囊胚(P < 0.05);免疫外科法分离4 d囊胚内细胞团的贴壁率和原代克隆形成率显著高于以同样方法分离培养的3.5 d囊胚(P < 0.05).结果显示用免疫外科法分离4 d囊胚更适合于昆明小鼠胚胎干细胞的体外分离培养.
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鼠囊胚在饲养层上的生长行为
目的比较自然孵化法、去透明带法、免疫外科法去滋养层三种方法对胚胎贴壁率、平均贴壁时间及内细胞团(ICM)克隆形成率的影响.观察鼠囊胚在小鼠原代胎儿成纤维细胞饲养层上的生长行为.方法超排卵获得囊胚,随机分成A、B、C 3组.A组:自然孵化法;B组:去透明带法;C组:免疫外科法去滋养层,分离获得ICM.观察鼠囊胚及ICM在饲养层上的生长行为.结果 3组胚胎贴壁率、ICM克隆形成率、平均贴壁时间分别为A组:83%、83%、36～48h ;B组:82%、82%、24～36h ;C组:71%、71%、24～36h .滋养层细胞与ICM同时增殖,但滋养层细胞扩展范围小,不形成一层半透明膜状结构.ICM在第4天时能够充分增殖且未分化,垂直隆起生长,呈典型的卵圆柱状结构.结论三种方法对胚胎贴壁率、ICM克隆形成率无显著差异,去透明带法、免疫外科法使胚胎平均贴壁时间短于自然孵化法.
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人胚胎干细胞系NJGLLhES1的建立
目的:使用人类冷冻胚胎建立新的人胚胎干细胞系. 方法:将人类冷冻胚胎解冻后培养至囊胚,用免疫外科法分离内细胞团,以ICR小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层,机械法传代.将此细胞系命名为NJGLLhES1,检测其核型,对其碱性磷酸酶和特异性标记物(Oct-4,SSEA-3,SSEA-4,TRA-1-60,TRA-1-81)进行鉴定,并进行类胚体形成实验及畸胎瘤成瘤实验,对其体内外分化能力进行检测. 结果:NJGLLhES1已在体外培养逾1年时间.细胞呈人胚胎干细胞克隆样,具正常人类核型,碱性磷酸酶和胚胎特异性标记物的表达为阳性,可形成类胚体和畸胎瘤. 结论:成功建立人胚胎干细胞系NJGLLhES1,此细胞系具人胚胎干细胞形态特征,可长期稳定增殖且保持不分化状态,核型正常,在体内外具有多向分化潜能.
