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不同冷冻方法对小鼠卵母细胞发育潜能及细胞骨架的影响
目的 比较不同冷冻方法对不同成熟阶段小鼠卵母细胞复苏、胚胎发育及细胞骨架的影响,寻求佳的卵母细胞冷冻方法. 方法 分别以SOPS玻璃化及慢速法冷冻小鼠中期(MII)和生发泡期(GV)卵母细胞.解冻复苏后,分别作体外培养成熟(IVM)、体外受精(IVF)或固定作免疫荧光标记,统计复苏率、成熟率、受精率、囊胚率及纺锤体等细胞骨架指标. 结果 玻璃化冷冻组MII卵和GV卵母细胞的复苏率及囊胚率均显著高于慢速冷冻组(P＜0.05).慢速冷冻组中MII卵复苏率显著低于GV卵(40.4% vs 57.1%,P＜0.01).但同一种冷冻方法保存的MII卵和GV卵的受精率及囊胚率相比,均无显著性差异(P＞0.05).两组的GV卵成熟率无显著差异.玻璃化冷冻组GV卵的纺锤体、染色体及纺锤体和染色体正常率均高于慢速冷冻组GV卵但无显著差异. 结论论 玻璃化冷冻能有效改善冻融卵母细胞的复苏及胚胎发育;与MII卵比较,冷冻GV卵对细胞骨架损伤较小;两种冷冻方法均不影响GV卵冻融后成熟.
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不同计数方法对丝光绿蝇虫卵孵化率的影响
目的:比较不同虫卵定量计数方法对孵化率的影响.方法:将丝光绿蝇所产卵块分成3组,分别采用橡皮捣碎计数法、显微镜计数法、自然孵化计数法等三种方法定量计数,观察比较不同方法的虫卵孵化率.结果:橡皮捣碎计数法计数,虫卵的平均孵化率低.显微镜计数法计数和自然孵化计数法计数,虫卵的平均孵化率均高,其中采用自然孵化计数法计数,虫卵的孵化率高,但两者间虫卵的平均孵化率无统计学差异.后两者虫卵的平均孵化率均显著性高于前者.结论:橡皮捣碎计数法方法简单,计数迅速,对虫卵孵化的影响较大,适合在虫卵大量定量计数但无需观察虫卵孵化率的情况下采用,显微镜计数法计数和自然孵化计数法计数,计数相对较慢,对虫卵孵化的影响小,适合在观察孵化率、转种传代等情况下采用.
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中国带壳鸡蛋中沙门氏菌定量危险性评估的初步研究--Ⅰ.危害识别与暴露评估
为控制由食用鸡蛋而导致的沙门氏菌食物中毒,利用中国的资料与信息建立了带壳鲜鸡蛋沙门氏菌定量危险性评估模型,对中国带壳鲜鸡蛋的沙门氏菌污染情况进行定量评估.模型计算每年以带壳鲜蛋形式被消费的带染鸡蛋数量平均为2.5×108(5th～95th百分位点值:1.9×106～1.1×109)个,消费前每个污染鸡蛋中的沙门氏菌菌量平均70 CFU(5th～95th百分位点值:14 CFU与172 CFU),该定量危险性评估的框架为中国每年沙门氏菌病暴发的危险性提供了评估依据.
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中国带壳鸡蛋中沙门氏菌定量危险性评估的初步研究--Ⅱ.危害特征的描述与危险性特征的描述
为控制由沙门氏菌污染鸡蛋引起的食物中毒,对我国带壳鲜鸡蛋的沙门氏菌污染引起人群感染的危险性进行定量评估.带壳鲜蛋沙门氏菌定量危险性评估模型模拟了从农场到餐桌(即从生产到消费)由于消费带壳鲜鸡蛋引起沙门氏菌病的危险性.模型计算每年因食用被沙门氏菌污染的带壳鲜蛋而引起沙门氏菌病的人数平均为5.3×107人(5th～95th百分位点值:4.0×105～2.2×108).与全国疾病监测点的监测数据预测的沙门氏菌病例数据吻合,表明该模型可以合理地预测危险性.通过改变该模型的重要参数,评估了几种降低危险性措施的效果,发现控制鲜蛋贮存的温度与时间是影响危险性结果的重要因素.该评估方法的框架为我国今后进行其它类似的定量危险性评估提供了参考.
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2002年北京市市售鲜鸡蛋和生鸡肉的沙门菌污染情况调查
为了了解北京市市售鲜鸡蛋、生鸡肉的沙门菌污染情况,并为建立食物污染及中毒的预警系统提供数据基础,2002年7、8和9月从北京市四个区的集贸市场、超市、商场和街边小商店共采集鲜鸡蛋100件,生鸡肉100件,进行了沙门菌的定性、定量检测及血清分型.结果表明:鲜鸡蛋蛋液中未检出沙门菌,生鸡肉的沙门菌阳性检出率为30%,沙门菌在生鸡肉中的污染情况与销售温度有关.因此,控制沙门菌的污染来源和生鸡肉销售的温度条件是控制沙门菌污染的手段之一.然而,还需要进一步研究的是:鲜鸡蛋外源性污染情况的调查;销售温度与污染情况之间相关性的进一步证实.
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涂布平板计数法与MPN法定量检测禽肉和蛋中沙门菌的比较
为选择良好的禽肉和鸡蛋中沙门菌定量检测方法,通过染茵实验,分析比较了涂布平板计数法和MPN法,结果表明平板计数法优于MPN法.应用平板计数法检测了16份鸡蛋和26份禽肉试样.沙门茵检出限分别为1CFU/ml和100CFU/g.16份蛋类试样中均未检出沙门茵.26份鸡肉试样中,20份为沙门茵阳性,阳性率为77%.其中9份试样沙门菌数低于检出限100 CFU/g,其余试样茵数范围为1.5×102～2.5×105CFU/g.对3份-20℃保存5 d的阳性禽肉试样应用MPN法进行了冷冻前后沙门菌含量的比较分析,储存后的菌数比冷冻前略有增加.实验结果表明,在食物试样中杂菌污染严重或沙门菌水平较低的情况下,平板法不能准确进行沙门菌计数,仍需进行MPN定量检测.
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白纹伊蚊干燥卵保存登革2型病毒的实验研究
感染登革2型病毒的白纹伊蚊卵在(25±1)℃、光照14 h/天,75%±5%RH的相对干燥环境中保存42天,分别采用C6/36细胞培养分离病毒和RT-PCR方法,检测卵孵化的F1代蚊虫感染率.第1个生殖营养周环F1代蚊虫未检测和分离到病毒,PCR检测第2生殖营养周环蚊虫批阳性率为26.7%,低感染率为1∶112.5;第3生殖营养周环蚊虫批阳性率为27.8%,低感染率为1∶108.统计学检验结果表明第2和第3生殖营养周环卵孵化的F1代蚊虫感染率没有达到显著性水平(P＞0.05).结果表明感染白纹伊蚊卵在75%±5%RH的相对干燥环境中保存42天后,能在孵化的子代蚊虫中检测和分离到病毒,证实伊蚊卵在干燥环境中能够保存卵内病毒.
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椭圆食粉螨主要发育期的形态学观察
目的 用光学显微镜观察椭圆食粉螨主要发育期的形态特征. 方法 采集一面粉厂的面粉灰尘样品,分离孳生螨,纯化后清洗,制备标本玻片,光学显微镜高观察椭圆食粉螨主要发育期的形态特征. 结果 光镜估见椭圆食粉螨雄性成螨呈白色,有光泽;螯肢粗壮,足4对,均呈深棕色;体椭圆,背上着生4对刚毛.肛门两侧着生1对圆形的肛门吸盘,其前方着生一对肛前毛.肛门后着生3对肛后毛.雌性成螨肛门孔周围有肛毛4对,肛后毛2对.幼螨足3对,后半体发育不完全,外生殖器尚未发育,有1对长的肛后毛.卵椭圆形,白色或乳白色,半透明. 结论 用光学显微镜能够清晰观察到椭圆食粉螨的主要发育期的形态特征,可为该螨的形态学鉴定提供实验依据.
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日本血吸虫云南品系SIEA对小鼠感染皖鄂品系血吸虫的免疫保护作用
目的 观察日本血吸虫云南品系未成熟卵可溶性抗原SIEA免疫小鼠后攻击感染皖鄂品系血吸虫尾蚴,是否也能诱导出免疫保护效果.方法 20只ICR小鼠随机分为免疫组和对照组,经日本血吸虫云南品系SIEA免疫后攻击感染皖鄂品系血吸虫尾蚴,感染后46 d观察减虫率、粪卵减少率、雌虫子官内虫卵数、肝表面虫卵结节数、肝脏各期虫卵数及各期虫卵构成比.结果 SIEA免疫后粪卵及雌虫子宫内虫卵减少率分别为34.45%,23.69%(P＜0.05);肝表面虫卵结节密度下降29.03%(P＜0.05);肝组织内虫卵减少29.07%(P＜0.05),成熟虫卵减少48.41%(P＜0.05).肝组织内成熟虫卵比例下降,未成熟卵比例增加(P＜0.05).结论 日本血吸虫(云南品系)未成熟卵可溶性抗原(SIEA)的抗原性较强,小鼠经云南品系SIEA免疫后攻击感染皖鄂品系血吸虫尾蚴也诱导小鼠产生了抗卵胚发育及抗雌虫生殖免疫力,结果提示将来在中国大陆使用SIEA疫苗时,似可不必考虑血吸虫品系的影响.
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低温对家蝇卵及蛹的影响
目的探讨低温对家蝇卵孵化率以及蛹羽化率的影响.方法室内连续饲养的家蝇第4代卵,置于2℃分别处理1、2、3、4和5 d后,取出置于室内(26℃)孵化,记录处理不同时间后的孵化率.第4代1日龄蛹和3日龄蛹,分别置于2℃和6℃处理1、2、3、4和5 d后,取出置于室内羽化,记录不同日龄以及不同时间的低温处理后的羽化率.结果家蝇卵经不同时间2℃低温处理后的孵化率依次为(91.52±7.70)%、(85.93±18.99)%、(48.52±19.48)%、0、0;家蝇1日龄蛹经不同时间2℃低温处理后的羽化率依次为(75.00±13.54)%、(51.25±13.15)%、(30.00±15.81)%、(6.25±6.29)%、(6.25±4.79)%;1日龄蛹经不同时间6℃低温处理后的羽化率依次为(88.75±4.79)%、(66.25±10.31)%、(40.00±12.91)%、(37.50±18.48)%、(12.50±6.45)%;3日龄蛹经不同时间2℃低温处理后的羽化率依次为(90.0±7.07)%、(78.75±11.09)%、(57.50±9.57)%、(61.25±11.09)%、(32.50±22.55)%;3日龄蛹经不同时间6℃低温处理后的羽化率依次为(92.50±5.00)%、(90.00±10.80)%、(88.75±2.50)%、(90.00±5.77)%、(66.25±10.31)%.结论家蝇卵经2℃低温处理4 d后即不能孵化幼虫,卵对低温的耐受力比蛹弱.温度越低,蛹羽化率越低,低温处理时间越长,蛹羽化率越低;蛹日龄越大,耐受低温能力越强.
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德国小蠊雌虫卵及卵巢的动态变化
目的:实验观察德国小蠊雌虫卵及卵巢的动态变化.方法:测量雌虫卵及卵巢的大小.结果:雌虫羽化后第1,2天,卵发育缓慢,体积无明显变化;羽化后第3～7天,卵明显增大,随发育时间延长卵的大小呈幂指数增长.卵的体积与发育时间的关系,可用二次抛物线方程表示.不同发育时间虫体的大小变化不大,但卵巢形态明显改变,左侧卵巢中平均有21.51条卵小管,右侧卵巢有21.77条卵小管.结论:本实验为德国小蠊的形态学、生理学和生态学研究提供了数据.
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滞育及冷暴露对白纹伊蚊卵Hsp70基因表达的影响
目的 研究白纹伊蚊卵在滞育以及冷暴露条件下,热休克蛋白70基因(Hsp70)的表达情况,探究Hsp70在增强白纹伊蚊卵耐寒性方面的作用.方法 以无冷暴露的非滞育卵作为对照组,采用RT-qPCR方法检测白纹伊蚊滞育卵和非滞育卵Hsp70 mRNA的表达情况.结果 室温25℃条件下,滞育卵与非滞育卵表达的Hsp70差异无统计学意义(P=0.392).与对照组相比,冷暴露后蚊卵Hsp70表达量均增加,且滞育卵Hsp70的表达量明显高于非滞育卵的表达量,分别是其对照组的16.44和5.22倍.结论 Hsp70并不是白纹伊蚊滞育期间的重要组成部分,但是在冷暴露的恢复期表达量上调.
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生物试块(禽蛋)检测超声仪分辨力和灵敏度的研究
目的 探讨禽蛋能否作为一种检测超声仪分辨力和灵敏度的生物试块.方法 选用多种禽蛋作为生物试块,采用5种不同类型高频彩色多普勒超声仪分别检测不同状态下的禽蛋,分析比较各仪器声像图的分辨力、清晰度和灵敏度.结果 5种超声仪均能显示禽蛋内部组织结构,但图像的微细分辨力、清晰度、灵敏度略有不同,可初步判断仪器性能高低.结论 禽蛋可作为一种生物组织对比试块,检测超声仪器的灵敏度和分辨力,评价仪器性能.
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基于微阵列比较基因组杂交技术的胚胎植入前遗传学诊断和筛查在不同阶段胚胎中的临床应用结局分析
目的 探讨微阵列比较基因组杂交(array-CGH)技术在胚胎植入前遗传学诊断或胚胎植入前遗传学筛查(PGD/PGS)中的应用效果及不同胚胎阶段活检的临床结局的差异.方法 回顾性分析2011年7月至2015年8月在南京医科大学第一附属医院进行PGD/PGS治疗的381个周期,其中, PGD 320个周期,采用卵裂期活检156个周期、囊胚期活检164个周期;PGS 61个周期,采用卵裂期活检23个周期、囊胚期活检38个周期.活检标本采用单细胞全基因组扩增结合array-CGH技术行染色体拷贝数分析.所有移植周期均采用单胚胎移植,以活产率作为主要临床结局的评价指标.结果array-CGH技术在PGD/PGS中的明确诊断胚胎比例达96.9%~99.1%.PGD活检周期中,卵裂期活检的每移植周期活产率和每活检周期活产率分别为50.0%(58/116)、37.2%(58/156),而囊胚期活检者分别为67.5%(85/126)、51.8%(85/164),分别比较,差异均有统计学意义(P均<0.01).PGS活检周期中,卵裂期活检的每移植周期活产率和每活检周期活产率均为34.8%(8/23),而囊胚期活检者均为42.1% (16/38),分别比较,差异均无统计学意义(P均>0.05).结论 array-CGH技术在PGD/PGS中的应用具有高诊断率,基于array-CGH技术的PGD/PGS可获得理想的临床活产率.在PGD周期中,囊胚期活检比卵裂期活检具有更高的活产率.
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慢速程序化冷冻与玻璃化冷冻对第3天分裂期胚胎发育潜能的影响
目的 比较慢速程序化冷冻法(慢速法)和玻璃化冷冻法(玻璃化法)对第3天分裂期胚胎发育潜能的影响.方法 选择因输卵管阻塞或男性少弱精因素行体外受精(IVF)或卵母细胞胞质内单精子注射(ICSI)治疗的患者,挑选在行IVF或ICSI后第3天剩余优质胚胎数目超过4个者80例进入本研究.随机将每例患者的2个胚胎用玻璃化法冷冻,另外2个用慢速法冷冻;冷冻复苏后随机抽取40例患者移植慢速法冷冻的胚胎,另40例患者移植玻璃化法冷冻的胚胎,比较2种冷冻方法对胚胎发育潜能的影响.结果 冷冻复苏后待移植的胚胎共160个,其中慢速法冷冻80个,复苏后存活73个(91%,73/80),移植后40例患者中15例(38%,15/40)获得临床妊娠,其中3例(20%,3/15)为双胎妊娠,余为单胎妊娠,胚胎着床率为25%(18/73);玻璃化法冷冻胚胎80个,复苏后存活71个(89%,71/80).移植后40例患者中19例(48%,19/40)获得临床妊娠,其中9例(47%,9/19)为双胎妊娠,余为单胎妊娠,胚胎着床率为39%(28/71),与慢速法相比,玻璃化法的临床妊娠率和双胎妊娠率均有提高,但差异无统计学意义(P＞0.05),而胚胎着床率则显著提高,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 玻璃化法能够更好地保存胚胎复苏后的发育潜能,更适合第3天分裂期胚胎的冷冻保存.
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卵裂期胚胎可溶性人类白细胞抗原G的表达及其与胚胎发育的关系
目的观察卵裂期胚胎可溶性人类白细胞抗原G (soluble human leukocyte antigen G, sHLA-G)的表达,并探讨sHLA-G的表达与胚胎发育的关系.方法采用免疫组化标记法,检测177个卵裂期胚胎sHLA-G的表达情况.结果 177个卵裂期胚胎中,101个卵裂期胚胎有sHLA-G蛋白表达,sHLA-G的总表达率为57.1%(101/177).其中双原核受精卵发育形成的卵裂期胚胎sHLA-G的表达率为66.2 %(90/136),三原核受精卵发育形成的卵裂期胚胎sHLA-G的表达率为26.8 %(11/41),两者比较,差异有统计学意义(P<0.01).双原核受精卵发育形成的1级卵裂期胚胎sHLA-G 的表达阳性率为64.3%(18/28),2级卵裂期胚胎为91.7%(66/72),3级卵裂期胚胎为16.7%(6/36).3者比较,差异有统计学意义(P<0.01).三原核受精卵发育形成的Ⅰ级卵裂期胚胎sHLA-G的阳性率为88.9%(32/36),与双原核受精卵发育形成的Ⅰ级卵裂期胚胎比较,差异有统计学意义(P<0.01).双原核受精卵发育形成的≤4个细胞的胚胎sHLA-G的表达率为56.7%(34/60), 5个细胞及6个细胞的胚胎为67.9%(36/53),7个细胞及8个细胞的胚胎为87.0%(20/23),3者比较,差异无统计学意义(P>0.05).结论卵裂期胚胎有sHLA-G蛋白表达;且sHLA-G表达与胚胎发育有关.
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卵裂期发育延缓胚来源的人类胚胎干细胞系的建立
目的 观察体外受精(IVF)周期中24 h内不发生卵裂的第3天(D3)发育延缓胚的体外发育潜能,为建立人胚胎干细胞库提供新的材料来源.方法 通过囊胚序贯培养法将卵裂期发育延缓胚培养至囊胚,观察囊胚形成率及囊胚质量.用逐步logistic回归分析囊胚形成率与卵裂球数、卵裂球对称性及卵裂球碎片比率的相关性.用免疫外科法去除滋养细胞,将得到的原代克隆接种于小鼠胚胎成纤维细胞上,体外传代并鉴定.结果 120枚卵裂期发育延缓胚培养出囊胚22枚(囊胚形成率18.7%).第6天早期囊胚、囊胚、满囊胚、扩张胚、孵化胚及孵化后囊胚的比率分别为5.9%、23.5%、35.3%、23.5%、5.9%及5.9%.内细胞团分级及滋养外胚层分级均仅有1个为A级,其余均为B或C级.发育延缓胚的囊胚形成率与卵裂球数、卵裂球对称性相关,而与卵裂球碎片比率无关.获得内细胞团7个,原代克隆3个,成功培养出2株人类胚胎干细胞系(hESC),并具有hESC的生物学特性:碱性磷酸酶(AKP)、阶段特异性胚胎抗原(SSEA)4、肿瘤排斥抗原(TRA)1-60、TRA-1-81呈阳性;悬浮培养可形成拟胚体;在严重免疫缺陷(SCID)小鼠体内可形成畸胎瘤;分别传45及35代后核型正常.结论 部分发育延缓胚可以发育为囊胚,从而可为建立人胚胎干细胞系提供新的材料来源.
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卵裂期活检对胚胎体外发育能力的影响
目的探讨不同的活检方法、活检时机和活检细胞数对胚胎体外发育能力的影响.方法选取体外受精-胚胎移植剩余的形态学分级为Ⅰ级的胚胎154个,对其中第1阶段的66个胚胎分别行化学法(26个)、机械法(20个)取出1个卵裂球,并设对照(20个);对第2阶段的88个胚胎分为用化学法取出2个卵裂球(44个)和对照(44个).观察记录活检时胚胎细胞数、活检时间、活检后卵裂球是否退化、活检后胚胎体外发育情况及囊胚总细胞数.结果 (1)化学法的活检时间为(231±20) s,明显短于机械法的(262±23) s(P<0.01);而囊胚形成率为65%,高于机械法的35%(P<0.05).(2) 6-细胞胚胎的囊胚总细胞数为(44±4)个,低于7～8-细胞胚胎的(49±5)个和≥9-细胞胚胎的(50±6)个(P<0.05);细胞融合的≥9-细胞胚胎活检后不仅囊胚形成率(20%)低于对照(67%,P<0.05),且活检后卵裂球退化率(50%)高于无细胞融合的胚胎(17%,P<0.05).(3)取出1个或2个卵裂球胚胎的囊胚形成率和囊胚总细胞数与对照比较,差异均无显著性(P>0.05),而6-细胞胚胎取出2个卵裂球后囊胚形成率(1/8)低于对照(5/8,P<0.05).结论化学法活检比机械法更为快速、安全;合适的活检时机为受精后第3天≥7-细胞、细胞融合前;≥7-细胞胚胎可取出2个卵裂球.
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奶牛卵泡超数同步发育及其卵母细胞的发育潜能
目的 建立促奶牛卵泡超数同步发育的方法,并利用体细胞核移植和分子技术评价来自这些卵泡的卵母细胞发育潜能.方法 用E2-P4对淘汰的高产奶牛进行联合处理后,分别对其实施不同组合的外源促性腺激素处理 [FSH 12 h组,FSH 48 h组,FSH 48 h-LH 6 h组(简称LH 6 h组),FSH48 h-LH 26 h组(简称LH 26 h组)] 以促进其卵泡超数同步发育;然后从卵泡中回收COCs进行体外成熟,排放第一极体的卵供作优质种牛的体细胞核转移(nuclear transfer,NT)受体,以评价卵的发育潜能.结果 E2-P4能成功地诱导奶牛卵巢中产生一个新的卵泡起始波,并能保证卵泡在外源促性腺激素作用下实现超数同步发育;上述四组不同组合外源促性腺激素处理的卵母细胞衍生的NT重构胚经体内培养7 d后,后3组的囊胚发育率显著高于FSH 12 h组和对照组(P<0.01);将这些克隆囊胚移植同步发情的受体牛子宫后,仅LH 26 h组的卵所获得的克隆胚能实现全程发育(直至克隆小牛出生).经RT-PCR分析颗粒细胞中FSHr、LHr 和连接蛋白43(Connexin 43,Cx 43)等mRNA含量变化,以及Western印迹分析其Bcl-2和Bax蛋白表达水平的变化,证实该组卵巢提供的同步发育卵泡为早期闭锁卵泡.结论 E2-P4-FSH48h-LH26h组合处理可人为调控牛卵泡的同步发育;处于早期闭锁状态卵泡的卵母细胞具备较高的发育潜能.
关键词： 奶牛 卵 E2-P4-FSH-LH组合处理 重构胚发育潜能 -
乙型肝炎病毒感染后表型不一致的单卵孪生子基因组CpG岛甲基化谱差异分析
目的进行乙型肝炎病毒感染后表型不一致的单卵孪生子基因组CpG岛甲基化谱差异分析,以发现可能的差异甲基化基因.方法采用改良甲基化间区位点扩增技术,根据人基因组CpG岛甲基化位点的两种主要碱基组合,-CGCG-和-CCGG-,用3种不同的酶切组合(SmaⅠ-XmaⅠ、HpaⅡ-MspⅠ、BssHⅡ-PauⅠ/BsePⅠ),同时采用Personal Molecular Imager FX分子成像系统及放射自显影相结合的方法,经Quantity One 4.4.0凝胶图像分析软件进行差异条带分析,分离回收差异甲基化条带并克隆入T载体,阳性克隆进行测序,将测序结果进行BLAST分析,初步了解与乙型肝炎病毒感染后表型不一致的单卵孪生子相关的差异甲基化基因情况.结果在一对表型一致的单卵孪生子间基因组CpG岛甲基化分析显示条带几乎相同,而在另一对表型一致以及一对表型不一致的单卵孪生子之间均存在差异甲基化条带,前者差异甲基化条带数目少于后者,将得到的差异甲基化条带克隆入T载体,目前测序分析得到4个可能与乙型肝炎病毒感染后表型不一致的单卵孪生子相关的差异甲基化基因.结论乙型肝炎病毒感染后表型不一致的单卵孪生子间基因组CpG岛甲基化水平有差异,其对疾病表型的影响及机制尚需后续深入研究.
