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口腔黏膜细胞与膀胱黏膜下脱细胞基质复合物构建组织工程化尿道的实验研究
目的 探讨以兔口腔黏膜细胞与同种异体膀胱黏膜下脱细胞基质(BAMG)复合物构建组织工程化尿道的可行性.方法 新西兰雄性兔24只,距尿道外口2.0 cm剥离尿道黏膜(2.0 cm×0.8 cm)后,随机分实验组和对照组,每组12只.切取实验组兔口腔黏膜组织分离细胞,在有灭活的3T3细胞培养皿上进行培养扩增,将培养获得的第2代口腔黏膜细胞种植于BAMG(2.2 cm×1.0 cm)上,植入实验组兔尿道缺损区域;对照组单纯采用无细胞植入的BAMG修复尿道.分别于术后1、2、6个月观察动物排尿情况,行尿道造影,8 F尿管插管确定有无狭窄;随后处死实验兔,取修复段尿道黏膜组织行组织学检查.结果 细胞培养获得的口腔黏膜细胞形态均一,生长良好;组织形态学、扫描电镜观察见口腔黏膜细胞与BAMG具有良好的相容性.实验组兔术后1、2、6个月伤口愈合良好、排尿通畅,无尿瘘发生,组织学和尿道造影检查显示带细胞修复的尿道形态完整、清晰宽敞,无狭窄发生;术后6个月植入的口腔黏膜细胞仍然存在,并明显扩增.对照组兔则出现排尿困难、尿道狭窄,光镜下发现黏膜及黏膜下存在严重的炎症反应.结论 兔口腔黏膜细胞与同种异体BAMG复合后,可成功用于尿道缺损的修复,构建组织工程化尿道.
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脂肪干细胞复合膀胱脱细胞基质促进膀胱再生的实验研究
目的 探讨脂肪干细胞(adipose-derived stem cell,ADSC)在兔的组织工程膀胱重建中的应用.方法 采用自体脂肪干细胞和膀胱脱细胞基质(bladder acellular matrix graft,BAMG)构建兔组织工程膀胱.应用酶消化法分离培养兔自体的ADSC,并进行流式细胞鉴定.对新鲜的兔膀胱组织进行脱细胞处理制得BAMG.将ADSC扩增后接种于BAMG表面并进行体外培养,获得组织工程膀胱.对24只雄性新西兰兔行40％ ～ 50％膀胱部分切除,分为实验组和对照组,每组12只.实验组采用自体培养的ADSC构建的组织工程膀胱对缺损膀胱进行修复,对照组采用单纯的BAMG进行修复.术后24周进行膀胱造影并取材观察组织修复再生情况. 结果 镜下观察ADSC贴壁后绝大多数为纺锤形,细胞之间以细丝拉网.流式细胞仪检测结果CD90、CD4、CD105、CD166、CD34表达均为阳性,CD106、CD45表达为阴性.ADSC种植于BAMG表面生长良好.修补24周后,对照组和实验组膀胱容量分别为术前的(69.33 ±5.05)％和(94.68±3.31)％.组织染色分析对照组显示上皮层正常,黏膜下纤维组织增生而肌层较薄；实验组则显示了与自体膀胱相似的正常的3层组织结构. 结论 采用ADSC和BAMG构建组织工程膀胱是理想的膀胱替代修补材料.
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骨髓间充质干细胞联合膀胱脱细胞基质的标记与归巢
目前间充质干细胞的示踪与归巢技术在多个临床学科已进入临床治疗阶段,同时膀胱组织工程及生物材料科学的进展也为膀胱的损伤修复提供了技术支持,故本文就BMSCs的示踪及归巢在膀胱组织工程中应用的可行性及研究进展进行综述.
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骨髓间充质干细胞在膀胱脱细胞基质上的生长及分化
背景:传统方法多采用平滑肌细胞和移行上皮细胞构建组织工程膀胱,并进行支架材料的双面种植,但由于平滑肌细胞取材培养困难,且体外传代有限,双面种植较为困难.目的:实验拟验证以骨髓间充质干细胞及膀胱脱细胞基质构建组织工程膀胱的可行性.设计:基础实验研究.单位:中山大学附属第二医院林百欣医学研究中心.材料:实验于2006-03/2007-05在中山大学附属第二医院林百欣医学研究中心完成.实验室级别为卫生部部属医院开放实验室.1月龄SD大鼠,雌雄不限,体质量80～100g,由中山大学实验动物中心提供.新鲜猪膀胱取自南方医科大学动物实验中心.方法:采用全骨髓培养连续贴壁法体外培养大鼠骨髓间充质干细胞,并应用流式细胞仪检测其表面抗原.采用去污剂洗涤法制备猪膀胱脱细胞基质,并测定其纯度及特性.将第3代骨髓间充质干细胞接种到膀胱脱细胞基质上,以添加25 ng/L血管内皮生长因子(VEGF165)的培养液进行体外、体内复合培养,检测其相容性.体内实验以细胞单独培养为对照,体外实验以未植入细胞的材料为对照,并模拟合适的微环境诱导骨髓间充质干细胞生长分化,分别在4,8周后取出动物体内的复合材料行组织切片检查,并进行免疫组织化学角蛋白染色,检测上皮细胞再生情况.主要观察指标:骨髓间充质干细胞与膀胱脱细胞基质的生物相容性.结果:①采用全骨髓法成功培养出骨髓间充质干细胞,行流式细胞仪检测细胞表面抗原显示,传代第3代细胞CD29阳性细胞为99.43%.②制备的膀胱脱细胞基质具有良好的生物特性,镜下见均质状态的基质和细丝状的胶原纤维.体内外相容性实验表明骨髓间充质干细胞与膀胱脱细胞基质具有良好的相容性,细胞生长状态良好.③4周后组织切片检查可见组织中较多炎症细胞浸润,胶原及弹性纤维排列紧密,免疫组织化学角蛋白染色见有薄层、不连续的单层上皮生长,8周后可见组织中已无明显炎症细胞浸润反应,胶原及弹性纤维排列紧密,免疫组织化学角蛋白染色见有薄层、连续的多层上皮生长.结论:骨髓间充质干细胞与膀胱脱细胞基质具有良好的生物相容性,并且在体内与周围组织有良好的生物相容性,可以作为构建组织工程膀胱的材料.
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增强型绿色荧光蛋白标记兔脂肪干细胞体外复合膀胱黏膜下层的生长特性
背景:绿色荧光蛋白作为细胞示踪标记已得到广泛应用,作者所查尚未见到以增强型绿色荧光蛋白作为标记方法用于研究脂肪干细胞与膀胱脱细胞基质复合后体外生长特性的报道.目的:利用绿色荧光蛋白标记兔来源的脂肪干细胞,观察其作为种子细胞复合膀胱脱细胞基质体外培养的生长特性,为复合物回植体内时间提供参考.设计、时间及地点:细胞标记示踪实验,于2009-01/05在上海组织工程研究与开发中心及上海第六人民医院实验动物房完成.材料:取2只新西兰大白兔,制备膀胱脱细胞基质.取2只新西兰大白兔脂肪分离脂肪干细胞.方法:体外培养增殖后脂肪干细胞转染增强型的绿色荧光蛋白,转染前后根据增殖速度,绘制生长曲线.然后将增强型绿色荧光蛋白转染的第3代脂肪干细胞以30×106的浓度接种于1 cm×1 cm大小的膀胱脱细胞基质支架材料上培养.主要观察指标:观察细胞转染后的生长特性,检测复合后的细胞总数,荧光显微镜观察复合后细胞形态.结果:脂肪干细胞经转染后生长增殖速度未受明显影响.细胞DNA检测示复合培养7 d细胞增殖状态佳.荧光显微镜观察显示培养7 d细胞增殖良好,10 d后呈现老化形态.结论:增强型的绿色荧光蛋白转染不影响脂肪干细胞传代、增殖.脂肪干细胞-膀胱脱细胞基质复合物体外培养7 d左右回植较合适.
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干细胞与膀胱脱细胞基质构建组织工程管状移植物修复长段输尿管缺损
背景：临床上重建长段输尿管缺损的方法存在并发症多且创伤大等缺点，因此，需要寻找其他的修复方式。目的：探讨组织工程管状移植物修复长段输尿管缺损的可行性。方法：将兔骨髓间充质干细胞和膀胱平滑肌细胞种植到兔膀胱脱细胞基质的两面，培养7 d后制作成4 cm长的组织工程管状移植物，仅将膀胱平滑肌细胞种植到兔膀胱脱细胞基质构建组织工程管状移植物作为对照；新西兰兔25只，随机分为实验组20只和对照组5只，将2种组织工程管状移植物移植到兔体内修复输尿管缺损，修复同时利用网膜包裹，分别于术后2，4，8周取实验组标本做苏木精-伊红染色及免疫组化检测。结果与结论：组织学检查发现实验组尿路上皮层再生呈连续性，术后8周可见组织工程管状移植物管腔内覆盖多层尿路上皮结构及规则的平滑肌束，免疫组化可见uroplakinⅢa及CK AE1/AE3阳性，证实了组织工程管状移植物组织内有成熟上皮细胞覆盖，且上皮细胞之间有连接功能。对照组5只动物术后拔除输尿管支架管2周内均死亡，尸检见流出道瘢痕形成，组织工程管状移植物内腔闭锁，同侧肾脏重度积水，未作组织学观察。以上结果表明将骨髓间充质干细胞和膀胱平滑肌细胞种植于兔膀胱脱细胞基质上构建组织工程管状移植物修复长段输尿管缺损是可行的，组织工程管状移植物内腔有成熟上皮覆盖，骨髓间充质干细胞能促进尿路上皮再生。
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兔膀胱脱细胞基质负载大鼠毛囊干细胞的体外培养
背景：组织工程学的兴起为泌尿系组织或器官的修复和重建开辟了新的途径，膀胱脱细胞基质是较好的泌尿系组织工程修复的替代材料。
目的：构建毛囊干细胞与异种膀胱脱细胞基质为支架的细胞支架复合物，体外培养观察细胞在支架上的生长状态。
方法：制备新西兰兔膀胱脱细胞基质，通过扫描电镜和 Masson 染色检测材料脱细胞效果，采用二次沉淀法将第3代毛囊干细胞静态接种于膀胱脱细胞基质表面，倒置显微镜下观察细胞生长状态，并绘制细胞生长曲线，组织学检测和扫描电镜观察细胞在材料表面的生长状况。
结果与结论：制备的膀胱脱细胞基质为白色半透明膜状，扫描电镜下观察为纤维网状结构，未见细胞残留。Masson染色提示膀胱脱细胞基质为胶原结构，无明显细胞残留。细胞材料体外复合培养48 h后倒置显微镜下观察膀胱脱细胞基质周围毛囊干细胞生长状态良好，1周后扫描电镜下观察毛囊干细胞伸展、黏附于支架表面。结果可见毛囊干细胞与膀胱脱细胞基质体外培养具有良好的生物相容性。 -
膀胱脱细胞胶原基质复合血管内皮生长因子修复兔尿道缺损
背景:采用膀胱无细胞基质作为游离移植物修复尿道缺损,诱导尿道再生取得一定的成果,但该方法仍未能从根本上解决移植物血管再生不足的问题.目的:观察复合血管内皮生长因子的异种膀胱脱细胞基质修复兔尿道缺损的效果.方法:将30只成年新西兰大白兔随机分为5组,每组6只,模型组、对照组、实验组均制作尿道缺损模型,随后对照组、实验组分别采用猪膀胱脱细胞基质、复合血管内皮生长因子的猪膀胱脱细胞基质进行修复,同时设立正常组、假手术组.术后4,12周分批处死动物,进行尿道造影、尿流率及免疫组织化学检测.结果与结论:①实验组术后4,12周的平均尿流率高于模型组、对照组(P<0.05),与正常组、假手术组比较无差异;②术后12周尿道造影显示,实验组尿路线条流畅;模型组、对照组尿路线条欠流畅;③苏木精-伊红染色显示,模型组胶原纤维细胞较多,纤维排列紊乱,有较多淋巴细胞浸润;实验组胶原基质基本降解,新生胶原纤维排列规律,其间血管较多,未见血管瘤等;对照组见团块状胶原沉积,视野内血管较少;④术后12周Masson染色显示,实验组胶原组织沉积明显少于对照组、模型组(P<0.05),接近正常组和假手术组(P>0.05);⑤术后12周CD31染色显示,实验组新生血管数量明显多于对照组、模型组(P>0.05),接近正常组和假手术组(P>0.05);⑥术后12周a-SMA免疫组织化学染色显示,实验组再生肌肉含量明显高于对照组和模型组(P<0.05),接近正常组和假手术组(P>0.05);⑦结果表明,复合血管内皮生长因子的异种膀胱脱细胞基质修复兔尿道缺损,可促进移植物局部血管新生,提高再生尿道肌肉含量,加速局部胶原降解,改善尿道再生微环境,促进尿道更好地再生.
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骨髓间充质干细胞与膀胱脱细胞基质支架的生物相容性
背景：国内外许多研究者一直寻找理想的种子细胞与合适的支架材料复合，试图模拟接近正常生理功能的组织工程化尿路替代物。
目的：探讨骨髓间充质干细胞与兔膀胱脱细胞基质支架的生物相容性。
方法：采用密度梯度离心法分离培养兔骨髓间充质干细胞，将第3代兔骨髓间充质干细胞接种到兔膀胱脱细胞基质上进行复合培养，每天进行细胞计数，连续12 d，绘制细胞生长曲线，以单独培养骨髓间充质干细胞为对照组。
结果与结论：骨髓间充质干细胞成功种植到膀胱脱细胞基质上，倒置显微镜下可见骨髓间充质干细胞从膀胱脱细胞基质边缘爬出，膀胱脱细胞基质周围有大量长梭形骨髓间充质干细胞生长。接种5d内，两组细胞均呈现出平缓生长的状态，接种6-9 d，生长曲线逐渐变得陡峭，细胞呈倍数状态进行分裂生长，速度较快，接种10-12 d，再次趋于平缓状态。两组细胞生长曲线基本重合，可推断兔骨髓间充质干细胞与膀胱脱细胞基质生物相容性良好。 -
皮下预制膀胱脱细胞基质-丝素蛋白双层支架修复大鼠膀胱的实验研究
目的：观察膀胱脱细胞基质-丝素蛋白（Bladder acellular matrix graft-silk fibroin，BAMG-SF）双层支架经皮下预制处理后，修复大鼠膀胱扩大术后膀胱缺损的效果。方法取BAMG-SF置于大鼠皮下，分别经1 d、3 d、7 d和14 d后，行组织学染色，评价其体内情况；实验分4组：单纯BAMG-SF组，BAMG-SF皮下预制3 d组、预制7 d组、预制自体组织组（BAMG-SF皮下预制7 d后去除BAMG-SF，保留周围结缔组织），分别修复大鼠膀胱扩大术模型，术后4周行HE、Masson及相关免疫组化染色，评价其修复情况。结果皮下预制7 d，即有大量细胞长入；皮下预制14 d，材料可被自身组织包裹；皮下预制3 d组的血管及肌肉修复程度均优于其他组，自体组织组未见结石形成。结论 BAMG-SF双层支架材料可用于膀胱缺损修复，皮下预制3d组织修复效果好，而自体组织组可以避免结石形成。
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兔膀胱脱细胞基质对人骨髓间充质干细胞增殖、分化的影响
目的 研究兔膀胱脱细胞基质(BAMG)对人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)增殖及分化能力的影响,并探讨其构建膀胱修复材料的可行性.方法 采用正常人骨髓体外分离培养原代hBMSCs.用兔膀胱构建BAMG,制备BAMG浸泡液培养基,并以BAMG浸泡液培养基为基础配制成骨、成脂、成平滑肌分化的诱导剂.将hBMSCs分别用正常培养液、正常诱导液、BAMG浸泡液及BAMG诱导液培养.采用苏木素-伊红(HE)与Masson三色染色法进行组织形态鉴定.采用流式细胞术及活细胞荧光染料羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记法检测BAMG浸泡液培养基对hBMSCs的生长毒性;分别观察以BAMG浸泡液为基础的诱导剂对hBMSCs成骨、成脂、成平滑肌的分化能力的影响.结果 成功构建BAMG标本,与未处理的膀胱组织相比,已去除绝大多数细胞核,组织结构更加疏松、多孔.BAMG浸泡液与正常培养基对hBMSCs增殖无差异.诱导后的hBMSCs仍能高效分化为成骨、成脂、成平滑肌细胞.结论 BAMG不影响hBMSCs的增殖和分化能力,可作为支架材料,应用于膀胱组织工程中.
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利用内皮祖细胞、膀胱上皮细胞和平滑肌细胞构建泌尿系组织工程片状移植物
目的 探讨内皮祖细胞(EPCs)在体内促进组织工程片状移植物新生血管生成的可行性.方法 制作兔膀胱脱细胞基质(BAM),体外培养扩增兔膀胱上皮细胞、平滑肌细胞和EPCs,再将这3种细胞分别以1.0×108/L种植到BAM上,培养7d后制作成组织工程片状移植物;实验组为上皮细胞-平滑肌细胞-EPCs-BAM片状移植物,对照组为上皮细胞-平滑肌细胞-BAM片状移植物.将复合物种植于兔皮下,8周后取标本做苏木素-伊红(HE)染色并进行免疫组织化学检测.结果 成功培养兔膀胱上皮细胞、平滑肌细胞、EPCs.生长曲线显示3种细胞在BAM上生长分化良好.植入皮下实验结果显示,实验组HE染色及免疫组织化学显示移植物有明显的新生血管形成,上皮及平滑肌层再生良好.而对照组移植物出现挛缩,表皮不连续,血管化不明显.结论 利用EPCs、膀胱上皮细胞、平滑肌细胞和BAM构建的组织工程片状移植物在体内生长良好,EPCs在体内能促进移植物新生血管形成.
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膀胱脱细胞基质片的制备及其与尿路上皮细胞的联合培养
目的:将培养扩增的猪膀胱移行上皮细胞接种到自制的膀胱脱细胞基质(BAM)片上,探讨此法体外构建用于新膀胱黏膜移行上皮化改造的组织工程复合物的可行性.方法:取新鲜猪膀胱制备BAM片,将原代猪膀胱移行上皮细胞进行体外培养、扩增后接种到BAM片上,培养成多层细胞结构的组织工程复合物.通过组织学观察,了解所制备的BAM结构及细胞在BAM片支架上的黏附及生长情况.结果:此法制备的BAM片具有较完整的胶原结构.细胞在BAM片上黏附、生长和增殖良好,可形成多层细胞的组织工程复合物.结论:该方法可成功培养猪膀胱移行上皮细胞.制备的BAM片生物相容性良好.膀胱移行上皮细胞与BAM片联合培养构建成具有多层细胞的组织工程膀胱黏膜替代物,有望用于新膀胱的移行上皮重建.
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异源性膀胱脱细胞基质移植修复兔膀胱缺损的局部和全身安全性评价
目的 采用异源性膀胱脱细胞基质(bladder acellular matrix,BAM)移植修复兔膀胱缺损,检测组织再生和机体的组织反应情况,评价其生物安全性. 方法 将完整新鲜猪膀胱通过一系列物理、化学和酶消化法进行脱细胞处理,得到猪BAM,通过HE染色和扫描电镜观察其脱细胞效果和超微结构.将18只新西兰大白兔(体重2.5～3.0 kg)随机分为实验组(n=12)和对照组(n=6),行膀胱部分(约30％)切除术,实验组采用与切除面积等大的猪BAM替代修补,对照组直接行膀胱切口原位缝合.术后观察动物存活情况,分别于术后15d,1、2、3、6个月行血常规及肾功能、电解质检测.术后1、2、3、6个月行尿流动力学检测大膀胱容量、排尿点膀胱内压力以及膀胱顺应性;然后处死动物,大体观察膀胱再生情况,并取再生膀胱组织行HE染色及免疫组织化学染色;同时取周围脏器及淋巴组织,经大体观察及HE染色观察有无异常变化. 结果 制各的猪BAM完全去除了细胞成分,扫描电镜观察呈多孔样结构.实验动物均存活至取材各时间点,血常规检测示术后15d两组白细胞计数升高,之后逐渐恢复至正常水平,两组间差异无统计学意义(P＞0.05).肾功能、电解质检测提示两组间差异无统计学意义(p＞0.05),其中肌酐有上升趋势,但至术后6个月时仍维持在正常范围内.术后实验组大膀胱容量及膀胱顺应性与对照组相比明显恢复,术后3、6个月两组比较差异有统计学意义(P＜0.05);两组间各时间点排尿点膀胱内压力比较差异均无统计学意义(P＞0.05).组织学观察可见两组中均有尿路上皮层、平滑肌组织和血管的再生.两组术后1个月均可见慢性炎性细胞浸润,随后慢性炎性细胞明显减少(P＜0.05),直至基本消退;术后3、6个月,两组间慢性炎性细胞浸润程度评分比较差异无统计学意义(P＞0.05).随着时间推移,两组α-平滑肌肌动蛋白(a-smooth muscle actin,α-SMA)表达量明显增多(P＜0.05),对照组各时间点α-SMA表达量明显高于实验组(P＜0.05).取检全身其他器官及区域淋巴结经大体观察及HE染色观察均无异常改变. 结论 采用猪BAM进行异种移植修补兔膀胱缺损未发现明显免疫排斥反应,具有相对安全性.
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人骨髓间充质干细胞在兔膀胱脱细胞基质微环境中的生物学特性
目的 利用兔膀胱脱细胞基质(bladder acellular matrix graft,BAMG)构建微环境,从细胞增殖能力、表面标记物及分子蛋白水平探讨其对人骨髓间充质干细胞(human bone marrow-derived stem cells,hBMSCs)的影响.方法制备BAMG浸泡液培养基,MTT法检测其对hBMSCs增殖的影响;流式细胞仪检测hBMSCs表面标志物CD44、CD45、CD73及PDGFRβ的表达;RT-PCR检测BAMG微环境对PPAR、OCN、α-SMA等基因表达的影响,Western blot检测不同处理方法 OCT-4蛋白的表达情况.结果 hBMSCs与BAMG有良好的相容性;实验组与对照组细胞曲线均呈"S"型增殖,于第3天进入快速增殖期,第7天趋于平稳;两组细胞CD44、CD45、CD73、PDGFRβ的表达量基本一致,差异不具有统计学意义;OCN、PPAR、α-SMA两组均表达目的基因;Western blot法检测亦显示OCT-4阳性表达.结论 hBMSCs在兔BAMG的微环境中仍能良好保持原有的生物学特性,将该种子细胞与基质材料结合可构建需要的组织材料,为泌尿系统组织工程修复提供可能.
