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组织工程膀胱的历史、现状及未来
肠道被用于膀胱重建是膀胱重建的金标准.但肠道处在泌尿系中,会引起黏液分泌增加、代谢紊乱、感染发生、结石形成甚至癌变等一系列并发症,严重影响患者生活质量和生存寿命[1].探寻理想的膀胱替代物是医学界所面临的一项巨大难题.随着组织工程学的兴起和发展,组织工程膀胱的研究和临床应用均已取得显著成果,这为我们寻找理想的膀胱替代物提供了新的技术[2].我们回顾了组织工程膀胱研究的历史和面临的困难,并对组织工程膀胱的发展提出了一些具体建议.
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膀胱无细胞基质负载骨髓间充质干细胞体外构建组织工程膀胱复合物的研究
目的：：探索大鼠膀胱无细胞基质负载骨髓间充质干细胞体外构建组织工程膀胱复合物的可行性。方法：全骨髓贴壁培养法提取大鼠骨髓间充质干细胞( BMSCs),物理和酶消化法相结合制备大鼠膀胱无细胞基质( BAMG),将分离纯化的P3代BMSCs接种在BAMG上共同培养构建组织工程膀胱复合物,HE染色观察复合物的细胞生长情况,以P3代BMSCs的单独培养做对照,绘制两组细胞生长曲线图,对比评价BAMG对BMSCs生长有无影响。结果：(1)全骨髓贴壁培养法分离培养的BMSCs经流式细胞仪检测细胞表面标志物CD29、CD44抗原表达阳性,而CD34呈阴性表达。(2)应用物理法和酶消化法相结合成功制备BAMG,HE和扫描电镜均未见细胞残留,具有完整的胶原及纤维结构。(3) BMSCs与BAMG能黏附生长,体外成功构建组织工程膀胱复合物,其生长曲线和对照组基本相同。结论：全骨髓贴壁培养法能简单有效的增殖纯化BMSCs,物理法和酶消化法相结合可以成功制备BAMG,二者体外成功构建组织工程膀胱复合物。
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骨髓间充质干细胞联合膀胱脱细胞基质的标记与归巢
目前间充质干细胞的示踪与归巢技术在多个临床学科已进入临床治疗阶段,同时膀胱组织工程及生物材料科学的进展也为膀胱的损伤修复提供了技术支持,故本文就BMSCs的示踪及归巢在膀胱组织工程中应用的可行性及研究进展进行综述.
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骨髓间充质干细胞在膀胱脱细胞基质上的生长及分化
背景:传统方法多采用平滑肌细胞和移行上皮细胞构建组织工程膀胱,并进行支架材料的双面种植,但由于平滑肌细胞取材培养困难,且体外传代有限,双面种植较为困难.目的:实验拟验证以骨髓间充质干细胞及膀胱脱细胞基质构建组织工程膀胱的可行性.设计:基础实验研究.单位:中山大学附属第二医院林百欣医学研究中心.材料:实验于2006-03/2007-05在中山大学附属第二医院林百欣医学研究中心完成.实验室级别为卫生部部属医院开放实验室.1月龄SD大鼠,雌雄不限,体质量80～100g,由中山大学实验动物中心提供.新鲜猪膀胱取自南方医科大学动物实验中心.方法:采用全骨髓培养连续贴壁法体外培养大鼠骨髓间充质干细胞,并应用流式细胞仪检测其表面抗原.采用去污剂洗涤法制备猪膀胱脱细胞基质,并测定其纯度及特性.将第3代骨髓间充质干细胞接种到膀胱脱细胞基质上,以添加25 ng/L血管内皮生长因子(VEGF165)的培养液进行体外、体内复合培养,检测其相容性.体内实验以细胞单独培养为对照,体外实验以未植入细胞的材料为对照,并模拟合适的微环境诱导骨髓间充质干细胞生长分化,分别在4,8周后取出动物体内的复合材料行组织切片检查,并进行免疫组织化学角蛋白染色,检测上皮细胞再生情况.主要观察指标:骨髓间充质干细胞与膀胱脱细胞基质的生物相容性.结果:①采用全骨髓法成功培养出骨髓间充质干细胞,行流式细胞仪检测细胞表面抗原显示,传代第3代细胞CD29阳性细胞为99.43%.②制备的膀胱脱细胞基质具有良好的生物特性,镜下见均质状态的基质和细丝状的胶原纤维.体内外相容性实验表明骨髓间充质干细胞与膀胱脱细胞基质具有良好的相容性,细胞生长状态良好.③4周后组织切片检查可见组织中较多炎症细胞浸润,胶原及弹性纤维排列紧密,免疫组织化学角蛋白染色见有薄层、不连续的单层上皮生长,8周后可见组织中已无明显炎症细胞浸润反应,胶原及弹性纤维排列紧密,免疫组织化学角蛋白染色见有薄层、连续的多层上皮生长.结论:骨髓间充质干细胞与膀胱脱细胞基质具有良好的生物相容性,并且在体内与周围组织有良好的生物相容性,可以作为构建组织工程膀胱的材料.
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脱细胞膀胱黏膜下层支架材料的生物学评价
背景:脱细胞膀胱黏膜下层是一种天然的细胞外基质生物材料,主要由Ⅰ、Ⅲ型纤维胶原蛋白构成,是一种理想的生物支架材料.目的:脱细胞猪膀胱组织作为组织工程支架材料的生物学评价.方法:取适量健康猪膀胱置于PBS和叠氮钠的混合溶液,浸泡过夜,刮去膀胱黏膜层.用低渗、-80℃反复冻融、DNase和RNase混合液消化和NaOH裂解连续方法制备脱细胞膀胱黏膜下层.通过观察其组织学结构特征、DNA残留、细胞毒性、细胞黏附效果及皮下炎症反应等来综合评价脱细胞膀胱黏膜下层的生物相容性.结果与结论:正常猪的膀胱经改进的脱细胞方法处理后,绝大部分细胞组分被去处,细胞外基质结构保持完好.细胞毒性试验结果显示脱细胞膀胱黏膜下层细胞毒性为1级,DNA提取结果中未见有DNA残留,细胞黏附结果显示猪平滑肌细胞能在脱细胞支架上较好的贴附生长,SD大鼠皮下植入试验显示无明显的炎症反应.结果证实所制备的脱细胞膀胱黏膜下层结构保存完好,有良好的组织相容性,可能成为组织工程修复的替代材料.
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不同种子细胞在组织工程膀胱构建中应用的研究进展
组织工程膀胱构建的研究为膀胱缺损的修复提供了新的选择,它避免了传统的肠道代膀胱引起的代谢紊乱、感染、结石形成等并发症.组织工程膀胱构建研究中,种子细胞的选择、体外培养及扩增是关键,是成功构建组织工程膀胱必不可少的条件[1].理想的种子细胞应该具备来源广泛、易获得,体外易于培养扩增,与支架材料相容性好等优点.本文主要就不同的种子细胞在组织工程膀胱构建研究中的应用进展进行综述.
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组织工程膀胱的血管化及其策略
一些先天性的疾病(如膀胱外翻)或炎症、感染、肿瘤以及创伤等可引起膀胱结构和功能的缺失或损害.常常需要一定的组织或材料进行膀胱的修复和重建[1].在探索膀胱修复和重建的历史上,筋膜、膀胱粘膜下层、大网膜、小肠粘膜下层、合成材料等都南于生物相容性、机械力学性能以及植入物萎缩、纤维化、结石形成等并发症而宣告失败.迄今为止,利用肠道进行膀胱的修复和重建仍是进行膀胱替代的金标准[2].但是,由于肠道处在泌尿系的环境中,可能会引起代谢紊乱、感染、结石形成甚至恶变等一系列并发症[3-4].因此,探寻合理的膀胱替代物是医学界的一项挑战.而组织工程技术提供了新的思路和方法[2.5].
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生理范围内静水压力对体外培养的人膀胱平滑肌细胞的影响
为探索生理范围内的静水压对体外培养的人膀胱平滑肌细胞(HBSMCs)的影响,实验采用自行设计的静水压加压装置并按压力梯度分组,用HE染色观察细胞形态,用免疫荧光、流式细胞仪、逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)分别检测细胞骨架F-actin、细胞周期、增殖细胞核抗原(PCNA)与基质金属蛋白酶7(MMP-7).发现各组的细胞形态、骨架、细胞周期和增殖无明显差异,而各组间MMP-7 mRNA的表达呈现出随静水压力的升高而增加随后逐渐下降的趋势.因此,我们得出生理范围内持续静水压可能对体外培养的HBSMCs的形态、骨架、周期、增殖无明显影响,而对MMP-7 mRNA的表达具有一定的影响.
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犬膀胱平滑肌细胞的体外连续培养
目的 通过体外培养不同代次的犬膀胱平滑肌细胞,比较其生物学特征,探讨多次传代后的平滑肌细胞作为种子细胞的可行性,为构建组织工程膀胱和尿道筛选种子细胞提供方法和依据.方法 取体重10～12 kg的12月龄雄性犬膀胱肌层,混合酶消化法获取平滑肌细胞,并于含10%小牛血清的培养基中培养,观察比较不同代次细胞的形态变化及生长、增殖过程,电镜下观察细胞超微结构,并通过免疫组织化学方法检测特征性蛋白的表达.结果 体外培养的平滑肌细胞单层生长至亚融合状态后,倒置相差显微镜下细胞呈长梭形,并呈峰-谷样结构,可连续传至12代.生长曲线显示第7代以前的细胞具有相似的增殖特点,约每40小时为1次生长周期,透射电镜下可见平滑肌细胞特有的密体结构,平滑肌肌动蛋白免疫组织化学染色为阳性;第7代后细胞增殖逐渐迟滞,至第10代细胞内肌丝及密体结构消失.结论 犬膀胱平滑肌细胞可在体外连续培养,通过适当的纯化方法可获得大量高纯度的平滑肌细胞.第7代以前的甲滑肌细胞均可作为种子细胞,用于构建组织工程膀胱和尿道.
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自体骨髓间充质干细胞复合膀胱去细胞基质修复犬膀胱缺损的实验研究
目的 探讨利用自体骨髓间充质干细胞(BMSCs)复合膀胱去细胞基质(BA MG)进行犬膀胱缺损修复重建的可行性.方法 25只杂种犬,5只用于制备BAMG,20只随机分为两组进行膀胱部分切除术.A组用单纯BAMG修复膀胱缺损,B组用复合自体BMSCs的BAMG修复膀胱缺损.分别在术后1、2、4、8、12周取材进行组织学和免疫组织化学检测评价膀胱组织再生情况.结果 所有动物术后均存活.组织学检测结果表明B组术后2周时已有尿路上皮形成,术后8周和12周时在修复区再生出与正常膀胱组织相似的膀胱壁结构.A组术后4周观察到尿路上皮再生,术后12周时仍然缺乏良好的平滑肌组织再生.结论 自体BMSCs复合BAMG比单纯BAMG更能促进膀胱缺损区修复和组织再生.自体BMSCs是组织工程膀胱可供选择的种子细胞来源.
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体外诱导猪骨髓间充质干细胞向尿路上皮细胞分化的实验研究
目的 探讨体外诱导骨髓间充质干细胞(BMSCs)向膀胱尿路上皮细胞分化的可行性研究,为组织工程膀胱的建立提供一种新的种子细胞来源.方法 抽取猪的骨髓液在体外行全血原代培养、扩增及鉴定骨髓间充质干细胞.用机械分离法获取膀胱尿路上皮组织,对其行原代培养、扩增、鉴定并提取尿路上皮细胞培养液.选取第三、四代的BMSCs和尿路上皮细胞分成四组:A组:BMSCs+尿路上皮细胞+表皮细胞生长因子；B组:BMSCs+尿路上皮细胞条件培养液+表皮细胞生长因子；C组:BMSCs+表皮细胞生长因子；D组:BMSCs 2 mL.结果 用流式细胞仪检测BMSC表面特异阳性标志物CD29、CD44,阴性标志物CD45,结果均为阳性.用角蛋白AE1/AE3单克隆抗体鉴定尿路上皮细胞及实验A、B组结果均为阳性,C、D组均为阴性.结论 骨髓间充质干细胞具有多向分化的能力,模拟体内的微环境可使BMSC向尿路上皮细胞分化.
