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组织工程用猪膀胱无细胞基质的体外细胞毒性检测
生物相容性是评价组织工程支架材料的重要指标之一,是组织工程产品进行临床应用的前提和基础.本研究参照医疗器械生物学评价标准,对本实验室制备的猪膀胱无细胞基质进行体外细胞毒性测定,为其合理应用于组织工程提供实验依据.
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采用肌卫星细胞及异种无细胞基质构建组织工程膀胱的研究
目的探讨应用组织工程膀胱进行膀胱替代修复的可行性.方法采用自体肌卫星细胞(MDSC)和猪膀胱无细胞基质(PBAM)构建兔组织工程膀胱.应用Percoll非连续密度梯度离心法分离纯化培养兔MDSCs,采用去污剂洗涤法对新鲜猪膀胱进行脱细胞处理获得PBAM.MDSCs接种于PBAM表面并进行短暂体外培养,获得组织工程膀胱.雄性新西兰兔行膀胱大部分切除术,分别采用PBAM及构建的组织工程膀胱进行替代修补,每组6只,1、4、8、12周后进行膀胱造影并取材观察修复组织再生情况.结果非连续密度梯度离心法所得细胞纯度＞90%.酶消化法能有效去除膀胱中细胞成分,光镜及电镜观察无细胞成分残留,细胞毒性测定为1级,细胞相容性好.1周后所构建组织工程膀胱修补吻合区生长良好,12周后修补区组织结构基本接近正常膀胱,容积达到正常膀胱的80%,2组比较差异有统计学意义(P＜0.05).结论采用MDSC及PBAM构建的组织工程膀胱是理想的膀胱替代修补材料.
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膀胱无细胞基质负载骨髓间充质干细胞体外构建组织工程膀胱复合物的研究
目的：：探索大鼠膀胱无细胞基质负载骨髓间充质干细胞体外构建组织工程膀胱复合物的可行性。方法：全骨髓贴壁培养法提取大鼠骨髓间充质干细胞( BMSCs),物理和酶消化法相结合制备大鼠膀胱无细胞基质( BAMG),将分离纯化的P3代BMSCs接种在BAMG上共同培养构建组织工程膀胱复合物,HE染色观察复合物的细胞生长情况,以P3代BMSCs的单独培养做对照,绘制两组细胞生长曲线图,对比评价BAMG对BMSCs生长有无影响。结果：(1)全骨髓贴壁培养法分离培养的BMSCs经流式细胞仪检测细胞表面标志物CD29、CD44抗原表达阳性,而CD34呈阴性表达。(2)应用物理法和酶消化法相结合成功制备BAMG,HE和扫描电镜均未见细胞残留,具有完整的胶原及纤维结构。(3) BMSCs与BAMG能黏附生长,体外成功构建组织工程膀胱复合物,其生长曲线和对照组基本相同。结论：全骨髓贴壁培养法能简单有效的增殖纯化BMSCs,物理法和酶消化法相结合可以成功制备BAMG,二者体外成功构建组织工程膀胱复合物。
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猪膀胱无细胞基质生物支架材料中转化生长因子β1的含量测定
背景:天然生物支架材料可能含有一定量的生长因子,在组织工程膀胱构建中存有其潜在的生物学行为.目的:观察去细胞处理后猪膀胱无细胞基质支架材料中转化生长因子β1含量的变化.设计、时间及地点:细胞组织工程学实验,于2006-07/2007-03在中国医学科学院北京协和医院中心实验室完成.材料:取材0.5 h内的猪新鲜膀胱标本12个,采集自北京市资源肉联厂,随机分为对照组、去细胞组,6个/组.方法:去细胞组采用低渗-去污剂洗涤-核酸酶消化法对新鲜猪膀胱进行脱细胞处理,制备膀胱无细胞基质,对照组不做任何处理.主要观察指标:苏木精-伊红染色观察膀胱去细胞效果,采用二辛可宁酸法测定可溶性蛋白含量,酶联免疫吸附试验测定转化生长因子β1含量.结果:对照组新鲜膀胱组织细胞结构完整,去细胞组膀胱组织细胞成分已基本去除,未见有核成分残留.去细胞组可溶性蛋白含量为(0.143±0.053)%,转化生长因子β1含量为(113.31±43.02)ug/kg,均明显低于对照组(t=15.56,P<0.001;t=24.63,P<0.001).结论:采用低渗-去污剂洗涤-核酸酶消化法可有效去除猪膀胱细胞成分,但仍有一定量的转化生长因子β1残留,可能为种子细胞生长提供有利因素.
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猪源性膀胱无细胞基质在异种移植中的生物安全性
背景:猪异种移植过程中可能发生猪内源性反转录病毒跨种间传播的潜在危险,由此所带来的异种移植生物安全性问题逐渐受到关注.目的:观察去细胞过程对猪膀胱内源性反转录病毒的影响,以评价猪源性膀胱无细胞基质生物工程材料在异种移植中的生物安全性.设计、时间及地点:基因工程与组织工程动物体内实验,于2006-07/2007-03在中国医学科学院北京协和医院中心实验室完成.材料:正常健康雄性杂种犬8只,随机分为对照组2只,修补组6只,用于膀胱修补替代实验.取材0.5 h内的猪新鲜膀胱标本采集自屠宰厂.方法:采用低渗-去污剂洗涤-核酸酶消化法对新鲜猪膀胱进行脱细胞处理,制备膀胱无细胞基质移植物.对照组犬切除50%膀胱后原位直接缝合,不使用任何材料修补;修补组犬切除50%膀胱后,分别用面积约为原膀胱30%,40%,50%的膀胱无细胞基质移植物进行替代修补.分别丁移植前及移植后1个月抽取犬静脉血提取RNA和DNA,以猪Beta-actin序列片段扩增产物作为内参照,针对内源性反转录病毒gag区序列,选用特异性引物,采用PCR和RT-PCR法检测上述提取的DNA和RNA是否存在内源性反转录病毒序列片段,并对扩增产物进行测序用于同源性分析.主要观察指标:苏木精-伊红染色观察猪膀胱去细胞效果及DNA含量.PCR及RT-PCR扩增及测序结果.结果:经去细胞处理后,猪膀胱内的细胞成分完全去除,三维纤维支架保持完整,DNA含量低于1%.新鲜猪膀胱PCR和RT-PCR均检测到362 bp扩增条带,与Medline公布的内源性反转录病毒有94%的同源性;所制备的生物工程材料膀胱无细胞基质移植物、及其移植前后的犬外周血样本均未枪测到内源性反转录病毒序列的表达.结论:低渗-去污剂洗涤-核酸酶消化法制备的膀胱无细胞基质移植物町以去除猪膀胱内源性反转录病毒,能够有效预防内源性反转录病毒在物种间的交叉感染,具有良好的生物安全性,可作为生物工程材料进行异种移植相关实验.
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兔膀胱无细胞基质作为组织工程学细胞载体的评价
目的 评价膀胱无细胞基质移植物(BAMG)作为组织工程学细胞载体的可行性.方法 10只兔行半膀胱切除术,切取的一半膀胱制备BAMG.另选择20只兔行半膀胱切除术后,用BAMG重建兔膀胱.测定术前和重建术后8周时的膀胱容量、压力和顺应性.HE染色和透射电镜观察BAMG以及重建术后8、16周时的兔膀胱.结果 BAMG中未见细胞成分.重建兔膀胱8周时,BAMG中除多层移行上皮外,其余组分还不成熟.16周时,重建膀胱和正常膀胱组织已无法区别.重建膀胱术后8周与术前比较,膀胱的容量、压力和顺应性无显著差异(P＞0.05).结论 BAMG是组织工程学技术中理想的细胞载体.
