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猪源性膀胱无细胞基质在异种移植中的生物安全性
背景:猪异种移植过程中可能发生猪内源性反转录病毒跨种间传播的潜在危险,由此所带来的异种移植生物安全性问题逐渐受到关注.目的:观察去细胞过程对猪膀胱内源性反转录病毒的影响,以评价猪源性膀胱无细胞基质生物工程材料在异种移植中的生物安全性.设计、时间及地点:基因工程与组织工程动物体内实验,于2006-07/2007-03在中国医学科学院北京协和医院中心实验室完成.材料:正常健康雄性杂种犬8只,随机分为对照组2只,修补组6只,用于膀胱修补替代实验.取材0.5 h内的猪新鲜膀胱标本采集自屠宰厂.方法:采用低渗-去污剂洗涤-核酸酶消化法对新鲜猪膀胱进行脱细胞处理,制备膀胱无细胞基质移植物.对照组犬切除50%膀胱后原位直接缝合,不使用任何材料修补;修补组犬切除50%膀胱后,分别用面积约为原膀胱30%,40%,50%的膀胱无细胞基质移植物进行替代修补.分别丁移植前及移植后1个月抽取犬静脉血提取RNA和DNA,以猪Beta-actin序列片段扩增产物作为内参照,针对内源性反转录病毒gag区序列,选用特异性引物,采用PCR和RT-PCR法检测上述提取的DNA和RNA是否存在内源性反转录病毒序列片段,并对扩增产物进行测序用于同源性分析.主要观察指标:苏木精-伊红染色观察猪膀胱去细胞效果及DNA含量.PCR及RT-PCR扩增及测序结果.结果:经去细胞处理后,猪膀胱内的细胞成分完全去除,三维纤维支架保持完整,DNA含量低于1%.新鲜猪膀胱PCR和RT-PCR均检测到362 bp扩增条带,与Medline公布的内源性反转录病毒有94%的同源性;所制备的生物工程材料膀胱无细胞基质移植物、及其移植前后的犬外周血样本均未枪测到内源性反转录病毒序列的表达.结论:低渗-去污剂洗涤-核酸酶消化法制备的膀胱无细胞基质移植物町以去除猪膀胱内源性反转录病毒,能够有效预防内源性反转录病毒在物种间的交叉感染,具有良好的生物安全性,可作为生物工程材料进行异种移植相关实验.
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猪作为供体的异种肝移植的研究与进展
背景:猪易于饲养,易繁殖,器官大小与人较匹配,并且可通过基因调控技术来增强供受体器官匹配性,因此猪是佳异种供体器官的大动物模型.目的:总结近年来猪作为供体的异种移植研究进展.方法:应用计算机检索PubMed数据库及万方数据库2001-01/2010-12有关以猪及非人类灵长类为供体进行异种移植的文献报道.结果与结论:使用猪作为供体的异种移植应用于临床可能会缓解供体器官短缺的问题,然而异种移植免疫学方面还存在某些障碍,可通过基因工程技术和开发新型免疫抑制剂来解决.至此所进行的研究还不能完全克服免疫排斥反应,并且除免疫因素外,还有异种病原的感染问题,如猪内源性反转录病毒.现在还不能确定是否具有潜在的感染性,随着进一步的研究,将会彻底克服免疫排斥和病毒感染等问题.
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超高压脱细胞方法制备组织工程血管支架
背景:构建组织工程血管支架的研究多集中于生物可降解支架和脱细胞同种或异种血管支架方面,但存在急需解决的若干问题:如生物可降解支架生物降解速度的控制以及植入脱细胞天然血管支架可能带来供体来源病毒细菌感染受体问题等.目的:采用超高压结合核酸酶洗涤方法(超高压脱细胞技术)处理同种异体血管,观察该方法的脱细胞效果以及猪内源性反转录病毒的去除情况.设计:对比观察实验.单位:日本国立心血管病中心研究所.材料:实验于2004-04/2005-04在日本国立心血管病中心研究所完成.选用健康雄性迷你猪幼猪,由日本九州鹿儿岛Japan Farm食用猪养殖场提供,体质量3～5 kg,猪龄1～3个月.实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准.实验涉及的主要试剂和仪器:Hoechst 33258为日本同仁化学研究所产品;超高压设备KOBELCO为神户制钢所产品:PCR为GENEAMP PCR SYSTEM 9700产品.方法:实验于2004-04/2005-04在日本国立心血管病中心研究所完成.无菌条件下取出猪降主动脉血管,用超高压设备以981 Mpa超高静水压(4 ℃)将供体来源细胞压碎,结合核酸酶的消化作用,PBS的搅拌洗涤,脱去细胞残片形成血管生物支架.主要观察指标: ①利用Hcechst 33258荧光探针,定量检测超高压脱细胞血管中DNA含量;用JEM100cx型透射电镜观察血管组织细胞成分去除和支架纤维保留情况;用JBM5200型扫描电镜观察支架的超微结构;100倍光镜下观察血管壁形态结构.即从组织学、分子生物学、免疫组组织化学水平评估超高压脱细胞方法的抗原去除效果. ②用PCR方法检测幼猪脱细胞血管中的猪内源性反转录病毒(PERV)前病毒DNA,评估超高压脱细胞方法对以猪内源性反转录病毒为代表的病原微生物的杀灭效果.结果: ①血管壁形态结构:血管壁纤维波浪状结构保存完好,组织?内的细胞均被除去. ②细胞去除效果:透射电镜见细胞成分均已消失.但保留有胶原纤维和弹性纤维.扫描电镜可见细胞已被完全脱去,只剩脱细胞支架. ③病原微生物的杀灭效果:经过超高压处理,猪内源性反转录病毒被成功灭活,无法测出.而采用表面活性剂脱细胞组无法将猪内源性反转录病毒灭活. ④DNA含量:超高压脱细胞处理前,血管中DNA含量为(31.7±3.5) mg/L;超高压脱细胞处理后,DNA含量为(1.16±0.23)mg/L,DNA含量显著降低(P＜0.01).提示超高压脱细胞方法已将细胞核及内容物大部分除去.结论:实验证明采用超高压脱细胞方法可基本除去支架内细胞成分,可以将病源微生物杀灭(将猪内源性反转录病毒成功灭活).
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异种器官移植及其伦理问题
目前,开展的异种移植研究主要以猪为供体源,面临的主要障碍是宿主抗移植物的免疫排斥反应(超急性排斥、急性排斥和慢性排斥)和猪内源性反转录病毒感染,并已取得一定进展.但异种移植引发的伦理问题也不容忽视,主要有跨物种感染、卫生资源分配、动物的权利和人格同一性等问题.
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中国特有小型猪内源性反转录病毒囊膜基因的克隆及进化分析
目的 克隆分析中国特有小型猪来源的猪内源性反转录病毒(PERV)囊膜基因(env),比较不同来源毒株的异同及系统进化关系.方法 应用RT-PCR的方法分别从中国实验小型猪、巴马香猪及五指山小型猪外周血淋巴细胞中扩增PERV env基因,克隆入T载体后测序;随后以PCR方法对克隆PERV env基因进行分型检测;后采用DNAsis及DNAstar软件对克隆的env基因和国外毒株env基因进行同源性及系统进化进行分析比较.结果 本试验所克隆的3株PERV env基因长度分别为1983bp、1986bp及1968bp,分别编码661、662和656个氨基酸,分型检测均为PERV-A亚型.同源性分析表明:国内这3个分离株env基因与国外来源于不同宿主的PERV-A、B、C亚型env基因的同源性分别在92.8～96.5%、69.4～73.4%及77.5%～80.8%之间.结论 PERV中国株的进化与A、B、C亚型分类有关,与宿主、分布地域关系不大,且PERV-A亚型与C亚型的亲源关系更近于B亚型.
