ADM、ADT对大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖的影响

目的:研究肾上腺髓质素ADM和肾上腺加压素ADT对肺动脉平滑肌细胞增殖的影响.方法:原代培养大鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMC),加入不同浓度的ADM、ADT培养72小时,固定前3小时掺入Brdu(5-溴-2-脱氧尿嘧啶核苷),用免疫荧光染色,观察对培养的PASMC增殖的影响.结果:10-7 ADM对PASMC增殖的抑制作用强,10-7 ADT对PASMC增殖的促进作用强.

盐酸抗原修复Brdu免疫组化检测在脑组织中的应用?

目的：探索简单有效的Brdu免疫组织化学染色抗原修复方法,提高实验成功率和改善实验结果。方法通过实验对三种抗原修复方法：①水浴锅煮沸修复法,②微波修复法,③Hcl酸化破膜法,采集图像进行比较,探索出Brdu免疫组织化学DAB染色有效方法。结果①水浴锅煮沸修复法：组织抗原暴露不全,背景较深,不能很好的显示Brdu的阳性结果。②微波修复法：组织中Brdu暴露不全,增加加热时间会使组织切片脱落严重,加热时间少则背景深,Brdu不能很好的与抗体结合,实验多数为阴性。③Hcl酸修复法：组织背景色较浅,Brdu阳性与背景色对比明显,同时能完全检测Brdu在细胞中的位置。结论 Hcl酸化修复法能很好的显示细胞核DNA镶嵌的Brdu,抗体容易进入细胞核中与之结合,显色效果明显,操作简单易行,同时无热源,安全性较好,是一种较为理想的检测方法。

不同浓度麝香酮对外源性骨髓间充质干细胞在体内迁移的影响

目的 研究不同浓度麝香酮对体外培养大鼠骨髓间充质干细胞(rat bone rnarrowmesenchymal stem cells,rBMSCs)在体内迁移的影响,以期筛选出佳的治疗剂量.方法 SD大鼠40只,随机分为4组,每组10只,采用牙科钻营造颅骨缺损的大鼠模型;利用贴壁筛选法提取大鼠骨髓间充质干细胞,传至第3代,并加入含有终浓度为10μmol/L BrdU进行标记,待细胞融合至于80％时,利用胰酶消化,配置成细胞密度为1×109cells/L细胞混悬液,然后通过尾静脉注入颅骨缺损的大鼠体内,回植后分别采用高(16.8μL/100 g)、中(8.4μL/100 g)、低(4.2μL/100 g)剂量的麝香酮灌服实验大鼠,空白组以灌服等体积生理盐水作为对照.14d后取出颅骨,固定,脱钙,做免疫组化后,荧光显微镜下,计数BrdU阳性细胞.结果 利用免疫组化处理后,进行灰度分析,麝香酮低、中剂量组与空白组比较,差异有统计学意义(P＜0.01),麝香酮高剂量组与空白组比较,差异无统计学意义(P＞0.05).结论 麝香酮具有促进外源性干细胞在体内的迁移作用,以中、低浓度麝香酮效果较好.

钙调素在生长相关蛋白-43调控细胞周期中的作用

目的 探讨钙调素-43( CaM)在生长相关蛋白(-43)(GAP-43)调控细胞周期过程中的作用. 方法 利用反转录病毒体系构建表达不同活性状态的GAP-43(即野生型、非磷酸化型和假磷酸化型GAP-43)NIH3T3细胞模型,并分别命名为表达野生型GAP-43 (3T3-G)、表达非磷酸化GAP-43(3T3-A)和表达假磷酸化GAP-43 (3T3-D)；另设对照组(转染空载体NIH3T3细胞).通过免疫组织化学及Western blotting鉴定各型细胞模型转入GAP-43的情况；应用免疫共沉淀检测各型GAP-43与CaM的功能关系；应用细胞生长曲线、BrdU累积标记法、BrdU脉冲标记法测定各型转GAP-43细胞的细胞周期. 结果 免疫组织化学和Western blotting结果显示,NIH3T3细胞能够表达转入的各型GAP-43.其中,3T3-A细胞增殖速度较其他细胞减缓.免疫共沉淀显示,3T3-A中有GAP-43和CaM相互作用表现；3T3-G中GAP-43和CaM有少量相互作用；3T3-D与3T3-P中则相互作用.累积BrdU测定,脉冲BrdU测定M期的实验表明,3T3-P细胞无明显周期改变；3T3-D与3T3-G细胞的周期延长；3T3-A细胞的周期明显延长并显示G1期明显延长. 结论 表达GAP-43的细胞其增殖表现可能是由于GAP-43结合了CaM,使之与Ca2+的结合减少而引起细胞周期(尤其是G1期)的延长.

全骨髓贴壁改良法分离培养人骨髓间充质干细胞及标记鉴定

目的 对比、探求分离培养人骨髓间充质干细胞(human mesenchymal stem cells,hMSCs)的方法,探讨hMSCs鉴定和标记的方法,为进一步的实验研究打下基础.方法 采集成人健康志愿者骨髓5mL,全骨髓贴壁法、全骨髓贴壁改良法、密度梯度离心法分离纯化、培养和扩增,获得hMSCs,对比三种方法.“慢冻速融”的原则进行细胞冻存、复苏.流式细胞术检测hMSCs的表面标志.hMSCs经5-溴脱氧尿嘧啶核苷(Brdu)标记,免疫细胞化学法测定并评估.结果 hMSCs运用三种方法均可获得,比较全骨髓贴壁改良培养法为方便高效分离获取hMSC、体外扩增迅速.流式细胞仪检测结果显示:CD44阳性及CD71弱阳性,表达率分别为95.05％,78.86％；CD34、CD45阴性,表达率分别为3.40％,2.88％.Brdu佳标记浓度和时间分别为10μmol/L和72 h.结论 hMSCs采取全骨髓贴壁改良法进行较好的纯化和扩增,Brdu标记可用于hMSCs的生长和分化的动态示踪观察.有望建立hMSCs库,为组织工程、细胞移植研究打好基础.

诱导骨髓间充质干细胞分化为肉芽组织中血管内皮细胞的在体实验研究

目的:探讨骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为肉芽组织中血管内皮细胞的可行性及其参与创面修复的可能机制.方法:抽取小型香猪的骨髓,经密度梯度离心分离、纯化间充质干细胞及培养扩增后,应用BrdU标记技术,以纤维蛋白胶为载体将已标记的细胞回植到提供骨髓的猪的全层皮肤缺损创面上,不同时间点(2、4、6、8、12周)取材,常规石蜡包埋、连续切片,行BrdU和血管内皮细胞第八因子(FⅧ)免疫组织化学染色,进行对比研究.结果:在细胞核内呈棕黄色着色的BrdU阳性细胞,多聚集在创面肉芽组织中的小血管周围,且有个别的血管内皮细胞也呈现BrdU阳性标记.同时BrdU阳性细胞胞浆中FⅧ亦呈阳性表达.结论:创面愈合的过程中骨髓间充质干细胞与肉芽组织中小血管的形成有密切的关系;在创面微环境下骨髓间充质干细胞可能分化为血管内皮细胞并参与创面修复的过程.

Brdu 标记的 rBMSCs 在大鼠体内的迁移

目的：5－溴－2－脱氧尿嘧啶核苷（5－bromo－2－deoxyuridine，Brdu）体外标记大鼠骨髓间充质干细胞（rBMSCs），通过尾静脉回植于大鼠体内，观察其是否在大鼠体内能向损伤部位迁移。方法采用贴壁筛选法培养rBMSCs，对rBMSCs进行鉴定，用Brdu标记细胞并计算标记率；大鼠颅骨骨缺损模型的建立；Brdu标记的rBMSCs体内回植；分别于7、14、21d后处死大鼠取出损伤部位的颅骨，并对其脱钙、制作切片；做荧光免疫组化染色；用荧光倒置相差显微镜来观察标本处是否有Brdu标记的rBMSCs。结果筛选纯化的骨髓间充质干细胞呈均一的成纤维细胞样，贴壁生长，以长梭形为主，漩涡状盘旋排列，CD45阴性表达，CD44、CD90表达阳性，rBMSCs经诱导后可向成脂、成骨分化。 Brdu标记率为86．2％，在标本处检测到Brdu标记的rBMSCs，14d迁移效果佳。结论 Brdu标记的rBMSCs可以进行大鼠体内的迁移研究。

不同标记方法对大鼠骨髓间充质干细胞标记的研究

目的 观察Hoechest33342、BrdU、DAPI对大鼠BMSCs标记情况,比较其标记效果的差异性;培养转基因绿色荧光小鼠的BMSCs,观察细胞生长情况和其荧光持续时间,比较其与荧光标记后的干细胞之间的优越性.方法 贴壁筛选提取大鼠BMSCs,培养至第三代,流式细胞仪检测其表面抗原,成骨、成脂诱导后染色;Hoechest33342、BrdU、DAPI标记大鼠BMSCs,检测标记后的大鼠BMSCs增殖率,显微镜下观察其荧光持续时间;观察转基因绿色荧光小鼠BMSCs在培养的不同时间段的细胞形态、荧光持续时间以及同上边3种标记方法比较的优缺点.结果 Hoechest33342、BrdU、DAPI可用于对BMSCs的标记;BrdU标记过程较长,在前期不存在荧光猝灭缺点,标记后经过荧光免疫组化处理后可见阳性细胞,Hoechest33342、DAPI标记过程较短,荧光持续时间较长,但此过程中必须避光,对操作带来了一定的困难.3种方法标记后对细胞增殖率无影响;转基因小鼠BMSCs生长较大鼠干细胞生长较慢,其优点是不用标记且荧光持续时间较长,用于细胞追踪研究更为方便可行.结论 干细胞有多向分化的潜能,因此有很好的研究价值和应用价值,对干细胞进行标记,为干细胞迁移、归巢机制的研究提供更好的研究平台.

We hypothesized that RNA interference to silence Nogo-66 receptor gene expression in bone marrow mesenchymal stem cells before transplantation might further improve neurological function in rats with spinal cord transection injury. After 2 weeks, the number of neurons and BrdU-positive cells in the Nogo-66 receptor gene silencing group was higher than in the bone marrow mesenchymal stem cell group, and significantly greater compared with the model group. After 4 weeks, behavioral performance was signiifcantly enhanced in the model group. Af-ter 8 weeks, the number of horseradish peroxidase-labeled nerve ifbers was higher in the Nogo-66 receptor gene silencing group than in the bone marrow mesenchymal stem cell group, and signiifcantly higher than in the model group. The newly formed nerve ifbers and myelinated ner ve ifbers were detectable in the central transverse plane section in the bone marrow mesenchymal stem cell group and in the Nogo-66 receptor gene silencing group.

BrdU标记冷冻胚胎雪旺细胞构建人工神经的研究

目的 寻求人工神经较为理想的种子细胞.方法 将体外扩增的胚胎兔雪旺细胞两步冷冻法处理后运用组织工程学的原理,5-溴脱氧尿嘧啶(5-bromodeoxyuridine,BrdU)标记后种植到去细胞基膜管中制备2 cm长人工神经桥接体,经培养后,桥接修复兔正中神经缺损.结果 16用后移植体再生神经中仍可见到大量BrdU阳性标记的雪旺细胞.冷冻雪旺细胞为种子细胞组,取得了与自体移植组相似的效果.结论 冷冻保存胚胎雪旺细胞有可能成为人工神经较好的种子细胞来源.

兔骨髓基质干细胞的培养与鉴定体系的建立

目的 探讨兔骨髓基质干细胞的培养与鉴定体系的建立方法与效果.方法 空气栓塞的方式处死SPF级新西兰大白兔6只,分离骨髓组织,利用贴壁培养分离纯化兔骨髓基质干细胞,多次传代后以流式细胞术检测细胞表面抗原;以BrdU标记骨髓基质干细胞,将骨髓基质干细胞注入兔颅内,分别于注射1、3周后取脑组织制作石蜡切片,进行免疫荧光染色.结果 通过贴壁法培养幼年兔骨髓细胞可获得较纯化的骨髓基质干细胞.免疫细胞化学染色显示骨髓基质干细胞中CD44+细胞率超过90％,细胞核未着色;流式细胞仪测定培养骨髓基质干细胞的CD90+细胞率为94.5％,CD34+细胞率为0.24％.BrdU标记显示得到了能够掺DNA合成期的骨髓基质干细胞,标记细胞所占的比例在40.0％以上.结论 通过贴壁法培养幼年兔骨髓细胞呈多角短梭形,可获得骨髓基质干细胞,BrdU可作为体内示踪骨髓基质干细胞的标志物之一.

电针对脑缺氧缺血新生大鼠海马结构Nestin与Brdu表达的影响

目的:通过观察电针对脑缺氧缺血新生大鼠海马结构中神经上皮干细胞蛋白(Nestin)与5-溴-2-脱氧脲嘧啶(Brdu)表达的影响,了解电针对脑缺氧缺血后神经发生水平的干预,为电针穴位疗法的临床应用提供实验依据.方法:100只7日龄健康Wistar大鼠,体重12～15 g,随机分为4组:空白对照组、模型判定组、缺氧缺血组与缺氧缺血后电针治疗组,各组动物(除空白对照组外)分别结扎左侧颈总动脉,然后将动物置于8%O<,2>～92%N<,2>混合气中2 h后取出.模型判定组动物在缺氧缺血48 h后处死,制备脑组织切片.脑缺氧缺血后电针组在缺氧缺血后恢复2 d,开始刺激"百会"和"大椎"两穴.24 d后除模型判定组外,各组动物分别取左侧脑组织制作标本,行Nestin与Brdu免疫组化染色.结果:脑缺氧缺血后电针组海马CA1区Nestin免疫阳性细胞数高于正常对照组及脑缺氧缺血组(P<0.05).脑缺氧缺血后电针组齿状回Brdu免疫阳性细胞数高于正常对照组及高于脑缺氧缺血组(P<0.05).结论:电针穴位治疗可明显提高(加强)脑缺氧缺血后海马结构神经发生的水平(能力).

BrdU免疫组织化学染色方法的改进(漂片法)

目的 改进用漂片法进行BrdU免疫组织化学染色时的封闭液,以减少组织切片破损.方法 用5-溴-2-脱氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2-deoxyuridine,BrdU)标记大鼠踏转轮运动中所引起增殖细胞,通过 ABC免疫组织化学方法染色.在染色过程中,比较不同的封闭液(羊血清、牛血清白蛋白、胰酶抑制剂)减少脑片破损的效果.结果 踏转轮运动可使大鼠海马齿状回BrdU阳性细胞数明显多于对照组.加入不同的封闭液后,组织片破损率明显下降,尤其是加入牛血清白蛋白和胰酶抑制剂组,但胰酶抑制剂组有非特异性染色.结论 牛血清白蛋白是较理想的封闭液.

二苯乙烯苷对癫痫大鼠神经细胞增殖的影响及其机制探讨

目的：观察二苯乙烯苷（ tetrahydroxystilbene glucoside， TSG）对癫痫（ epilepsy，EP）大鼠神经细胞增殖的影响，并探讨其可能机制。方法将SD大鼠随机分为假手术组、模型组、二苯乙烯苷干预组。应用立体定向脑室内微量注射的方法建立海人酸（ kainic acid， KA）诱导的大鼠癫痫模型。造模前30 min腹腔注射给药，致痫后6 h腹腔内注射TSG溶液（3 mg/kg）剂量，次日开始每日8时给予腹腔注射TSG溶液（3 mg/kg）剂量，每日1次，连续注射，共注射42 d，KA模型组动物及假手术组给予等量生理盐水腹腔内注射。用免疫组织化学技术观察TSG对大鼠海马齿状回颗粒细胞下层BrdU阳性细胞数目及海马齿状回区星形胶质细胞数目增殖的影响。结果癫痫发生后各组海马齿状回区及皮层均存在GFAP免疫反应阳性细胞，经统计分析二苯乙烯苷干预组较模型组GFAP免疫反应阳性星形胶质细胞减少，差异有统计学意义（ P＜0.01）；BrdU免疫组织化学染色研究显示二苯乙烯苷干预组较假手术组及模型组海马齿状回区细胞增殖数目增加（P＜0.01），差异有显著统计学意义。结论二苯乙烯苷存在抑制大鼠海马区星形胶质细胞增生，促进增神经细胞增殖的作用。

小鼠局部淋巴结实验(BrdU-ELISA)在25％氰氟草酯乳油皮肤致敏性检测中的应用

目的 采用小鼠局部淋巴结实验(BrdU-ELISA)法检测25％氰氟草酯乳油的致敏性.方法 1.选用雌性BALB/C小鼠进行实验,受试样品设为100％、50％、25％,同时设阴性对照组[丙酮:橄榄油(acetone:olive oil,AOO)=4:1]、阴性对照组(橄榄油)及阳性对照组(25％已基肉桂醛),连续双耳背面染毒3 d,第6天腹腔注射BrdU溶液(5 mg/只),24 h后采集耳后淋巴结称重等并通过BrdU-ELISA实验方法检测淋巴增殖情况.结果 各剂量组的小鼠体重与对照组比较,差异均无显著性(P>0.05);各剂量组的耳厚度增加和耳重均不超过25％;溶剂和空白对照组的刺激指数SI1和SI2<1.6,阳性对照组(25％已基肉桂醛)的刺激指数SI1和SI2>1.6,实验系统可靠;25％氰氟草酯乳油低、中、高剂量组的刺激指数SI1和SI2<1.6,无剂量反应关系.结论 25％氰氟草酯乳油的小鼠局部淋巴结实验结果为阴性,即25％氰氟草酯乳油为无致敏性.

叶酸对胎鼠神经干细胞体外增殖的影响

目的 探讨叶酸对体外培养的胚胎大鼠神经干细胞(neural stem cells,NSCs)增殖的影响.方法 本研究采用显微解剖、机械吹打、无血清悬浮培养方法 分离培养鼠胚大脑NSCs,用巢蛋白(nestin)免疫荧光染色对其进行鉴定,5'-溴脱氧尿嘧啶(BrdU)掺入法检测细胞增殖状态;设立正常对照组,叶酸低、高剂量(培养液中添加叶酸4.0 40 mg/L)和叶酸缺乏组(培养液中添加叶酸拮抗剂甲氨蝶呤0.4 mg/L);通过nestin+BrdU免疫荧光双标记和绘制细胞生长曲线(MTT法)检测叶酸对细胞增殖状态的影响.结果 无血清培养液中可形成大量呈nestin抗原阳性细胞组成的神经球,BrdU免疫标记证实培养的NSCs具有增殖能力.免疫荧光双标记和MTT结果 显示,两个叶酸干预组NSCs增殖能力较对照组显著增强.结论 体外培养的胚胎大鼠NSCs具有增殖和自我更新的能力;叶酸可以在一定程度上增强NSCs的增殖能力,促进神经干细胞的生长.

针刺人中穴对 MCAO 大鼠中枢神经系统神经干细胞增殖影响的研究

[目的]探讨针刺人中穴治疗缺血性脑卒中的神经发生机制。[方法]用 BrdU+/nestin+免疫荧光双标和蛋白免疫印迹法观察针刺对线栓法大鼠大脑中动脉阻断实验模型（MCAO）大鼠大脑新生神经细胞及皮质、海马、纹状体nestin 蛋白表达量的变化的影响。[结果]针刺组 MCAO 大鼠 BdrU+、nestin+和 BrdU+/nestin+细胞数均高于正常组、假手术组和模型组（P﹤0.05），模型组高于正常组和假手术组（P﹤0.05）；针刺组 nestin 在海马和皮质的表达量高于其他组别（P﹤0.05）。[结论]缺血缺氧能引起 MCAO 大鼠脑神经干细胞的增殖，而针刺人中穴能增强神经干细胞增殖作用，促进大脑功能的修复。

创伤性脑损伤对大鼠齿状回神经细胞新生的影响

目的:观察成年大鼠创伤性脑损伤后齿状回神经细胞新生的变化.方法:将雄性Wistar大鼠分为假手术组和液压打击脑创伤组,使用5-溴脱氧尿核苷(BrdU)标记新生细胞,免疫组织化学方法观察脑损伤后大鼠齿状回神经细胞新生水平的变化和规律.结摹:成年大鼠创伤性脑损伤后.在第3、7、14天,创伤组齿状回BrdU免疫阳性细胞数较假手术组明显增加(P<0.05),以受伤侧齿状回变化显著.结论:创伤性脑损伤可促进齿状回神经细胞新生.

激光共聚焦显微镜观察新生鼠海马齿状回神经干细胞的增殖

目的 观察新生鼠海马齿状回神经干细胞的形态及其分布.方法 新生7 d SD大鼠每天2次腹腔注射Brdu,至出生20 d及32 d分别取脑片标本,用Tritc(罗丹明)标记的麦芽凝集素及FITC标记的小鼠抗大鼠Brdu单克隆抗体行免疫荧光双染色,在激光共聚焦显微镜下观察大鼠海马齿状回神经干细胞的形态、分布特点及数量变化.结果 激光共聚焦显微镜观察显示,出生20 d大鼠海马齿状回Brdu阳性细胞主要聚集在颗粒下层,呈条带状分布,在海马的其他区域也有呈散在的阳性细胞存在,而出生32 d大鼠海马齿状回的神经干细胞呈散在分布,数目明显少于20 d大鼠.结论 新生SD大鼠海马齿状回存在一定数量的神经干细胞,其数量随着大鼠年龄的增大而减少.

用BrdU法检测外周血淋巴细胞hprt突变的方法学探讨

目的探索用5-溴脱氧尿嘧啶(5-bromodeoxyuridine,Brd U)法检测次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因(hypoxanthine-guanine phosphoribosy tra nsferase gene,hprt)突变的操作程序.方法用正交设计法就BrdU法的佳检测条件进行了探讨.结果本研究所得的佳操作程序是:将血样放入4℃冰箱中冷藏24 h;培养基中6-巯基鸟嘌呤(6-thioguanine,6 -TG)终浓度为1×10-4 mol/L;BrdU终浓度用1×10-4 mol/L;加入BrdU后培养时间为16 h;Giemsa染液浓度为4%;染色时间为15 min.结论 BrdU法是一种较好的检测hprt突变的方法.