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不同标记方法对大鼠骨髓间充质干细胞标记的研究
目的 观察Hoechest33342、BrdU、DAPI对大鼠BMSCs标记情况,比较其标记效果的差异性;培养转基因绿色荧光小鼠的BMSCs,观察细胞生长情况和其荧光持续时间,比较其与荧光标记后的干细胞之间的优越性.方法 贴壁筛选提取大鼠BMSCs,培养至第三代,流式细胞仪检测其表面抗原,成骨、成脂诱导后染色;Hoechest33342、BrdU、DAPI标记大鼠BMSCs,检测标记后的大鼠BMSCs增殖率,显微镜下观察其荧光持续时间;观察转基因绿色荧光小鼠BMSCs在培养的不同时间段的细胞形态、荧光持续时间以及同上边3种标记方法比较的优缺点.结果 Hoechest33342、BrdU、DAPI可用于对BMSCs的标记;BrdU标记过程较长,在前期不存在荧光猝灭缺点,标记后经过荧光免疫组化处理后可见阳性细胞,Hoechest33342、DAPI标记过程较短,荧光持续时间较长,但此过程中必须避光,对操作带来了一定的困难.3种方法标记后对细胞增殖率无影响;转基因小鼠BMSCs生长较大鼠干细胞生长较慢,其优点是不用标记且荧光持续时间较长,用于细胞追踪研究更为方便可行.结论 干细胞有多向分化的潜能,因此有很好的研究价值和应用价值,对干细胞进行标记,为干细胞迁移、归巢机制的研究提供更好的研究平台.
关键词： 绿色荧光 Hoechest33342 Brdu DAPI 细胞标记 -
两种荧光标记物对中枢神经系统内源性神经干细胞的标记效果比较
目的 观察DIL和DAPI两种不同的标记物对中枢神经系统内源性神经干细胞的标记效果.方法 清洁级健康成年SD大鼠36只,随机分为实验组(DIL组,DAPI组)和对照组(DMSO组,PBS组).使用立体定位仪,向实验组大鼠侧脑室注入0.2％ DIL或10μg/ml DAPI各10μl,对照组大鼠侧脑室相应注入DMSO或PBS各10μl.注射后2h和24h对动物进行神经功能损伤评分(NSS).采用激光共聚焦显微镜观察注射后1、3、7d脑室及脊髓颈、胸、腰段室管膜细胞的荧光标记情况,对目标区域荧光强度进行半定量分析,并对不同组别和时间点的脑室及脊髓标本测定结果进行比较.结果 注射DIL及DAPI后2h,大鼠NSS评分很低,与相应对照组相比差异无统计学意义(P＞0.05),24h后基本恢复正常.DIL注射后1d,侧脑室及各节段的脊髓室管膜细胞胞质均显示红色荧光,一直持续到注射后7d.DAPI注射后1d,侧脑室内标记的细胞核形态清晰,呈蓝色,脑室脉络丛大量细胞亦可见蓝色荧光标记,但脊髓各节段室管膜区的细胞均未见蓝色荧光,注射后3、7d的情况与1d类似.两种试剂标记后,目标区域内各时间点的荧光强度差异无统计学意义(P＞0.05).结论 DIL可对内源性神经干细胞的细胞质进行标记,适合作为侧脑室和脊髓室管膜内源性神经干细胞的标记物.DAPI可标记细胞核,适合用于侧脑室内源性神经干细胞的标记.脑室注射荧光染料对动物影响小,是一项相对安全的操作.
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超顺磁性氧化铁和DAPI双标记骨髓间充质干细胞
背景:骨髓间充质干细胞目前已经成为重要的组织工程种子细胞,而若想深入研究其在体内外增殖、分化的规律,首先需要解决如何能高效、安全地标记骨髓间充质干细胞.目的:观察超顺磁性氧化铁及DAPI对大鼠骨髓间充质干细胞的双标记效果及其对细胞存活、增殖以及凋亡的影响.方法:分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,用超顺磁性氧化铁及DAPI双标记后分别用普鲁士蓝染色法和激光共聚焦显微镜观察其铁标记率及荧光标记率.用锥虫蓝检测细胞活力;MTT法检测标记干细胞增殖力;Calcein-AM/PI以及AO/PI双染细胞,检测细胞存活率以及凋亡率.结果与结论:超顺磁性氧化铁及DAPI在体外双标记大鼠骨髓间充质干细胞效率高,可达100%;锥虫蓝染色显示标记细胞的存活率为97%;MTT法检测发现双标记干细胞组的活力以及增殖力与未标记干细胞组相比差异均无显著性意义(P > 0.05);Calcein-AM/PI染色,未标记细胞及双标记细胞的存活率分别为96%和95%;AO/PI染色,未标记及双标记细胞的凋亡率均为1%.提示超顺磁性氧化铁和DAPI双标记大鼠骨髓间充质干细胞后,对于干细胞的存活、增殖以及凋亡无影响.
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麝香酮对外源性骨髓间充质干细胞在颅骨缺损大鼠体内迁移的影响
背景:骨髓间充质干细胞是多向分化干细胞,在骨折愈合和中有着重要作用.如何促进其在体内迁移,进而促进骨缺损的修复,有着重要研究意义.目的:研究不同浓度麝香酮对外源性骨髓间充质干细胞在体内迁移的影响,探讨其促进骨折愈合的机制及其引经理论初探.方法:建立大鼠颅骨缺损的大鼠模型;贴壁筛选法提取干细胞,取第3代细胞,利用DAPI进行标记,然后尾静脉回植入颅骨缺损的大鼠体内.分别以0,42,84,168μL/kg麝香酮灌胃1次.结果与结论:与高剂量麝香酮组和空白组相比,低、中剂量麝香酮组骨缺损部分的骨髓间充质干细胞数量增加,干细胞因子和Fractalkine的表达水平明显增加.提示中低剂量麝香酮具有促进外源性干细胞在体内的迁移作用.
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CM-DIL和DAPI标记的骨髓间充质干细胞
背景：在有关“细胞移植”的实验研究中，细胞标记技术被广泛应用。CM-DIL与DAPI是细胞标记实验中常用的荧光染料，目前两者的对比研究报道较少。
目的：从体外实验与体内实验两方面，探讨两种荧光染料CM-DIL与DAPI在标记大鼠骨髓间充质干细胞方面的差异。
方法：用贴壁培养法获取、培养、扩增大鼠骨髓间充质干细胞，分别用CM-DIL与DAPI进行标记，锥虫蓝计数检测骨髓间充质干细胞的活力；MTS法检测骨髓间充质干细胞的增殖能力并绘制增殖曲线；倒置相差荧光显微镜下动态观察标记后1，2，3代骨髓间充质干细胞的荧光衰减情况。结扎SD大鼠冠状动脉前降支致心肌梗死。1周后于心肌梗死边缘处注射CM-DIL与DAPI标记的细胞，细胞移植后3 d取材观察骨髓间充质干细胞的分布情况。
结果与结论：体外实验中，CM-DIL与DAPI标记的骨髓间充质干细胞两者的早期增殖能力均低于对照组；两种染料标记后的第1代细胞的荧光阳性率均为100%，但DAPI标记后的第3代细胞的荧光强度明显减弱。体内实验中，CM-DIL组与DAPI组心肌组织冰冻与石蜡切片均检测到集中分布的荧光；CM-DIL组冰冻切片红色荧光比DAPI组的蓝色荧光边界清晰并且背景低；CM-DIL组还可以通过含细胞核染色的封片剂封片排除荧光假阳性。可见，CM-DIL染料比DAPI更适合对骨髓间充质干细胞进行体内示踪。 -
大鼠胚胎后肾间充质细胞体外标记的方法
背景:干细胞移植为慢性肾脏病的治疗提供了新的视角,特异性标记干细胞并体内示踪是这一领域研究的基础,目前尚无一种公认的适用于所有细胞的标记方法.目的:观察DAPI及绿色荧光蛋白标记细胞在阿霉素肾病大鼠体内的定位及分化,探讨便捷的大鼠胚胎后肾间充质细胞的体外标记方法.设计、时间及地点:分组对比观察,于2007-04/12在中南大学湘雅二医院完成.材料:清洁级雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠60只,体质量180～220 g,用于制备阿霉素肾病大鼠模型.方法:分别将DAPI、DAPI体外标记后肾间充质细胞、绿色荧光蛋白体外标记后肾间充质细胞,通过尾静脉注入阿霉素肾病大鼠体内:于细胞移植后1,3,5周行肾组织冰冻切片,观察DAPI及绿色荧光蛋白荧光分布,并ABC免疫酶染色法检测肾组织中绿色荧光蛋白表达.主要观察指标:比较DAPI及绿色荧光蛋白两种不同方法标记后肾间充质细胞在阿霉素慢性肾病大鼠肾内的定植情况,以及绿色荧光蛋白标记细胞不同时间点移植在肾内的定植改变.结果:①DAPI标记细胞及单纯DAPI尾静脉注射后1周,均可在肾小管上皮细胞中观察到DAPI阳性细胞,至移植后5周仍可观察到,但随时间延长荧光有减弱趋势.②绿色荧光蛋白标记细胞移植后1周,可在肾小管上皮细胞中观察到绿色荧光蛋白阳性细胞,至移植后5周仍可观察到,荧光无明显减弱.③ABC免疫酶染色法检测,显示绿色荧光蛋白阳性细胞主要表达于近端肾小管中,肾小球系膜区亦可观察到少表达:绿色荧光蛋白阳性产物主要表达于胞浆.绿色荧光蛋白表达半定量评分显示,标记细胞的早期应用阳性率大于晚期应用者,且随观察时间延长,阳性率有升高趋势.结论;后肾间充质细胞的脂质体感染法绿色荧光蛋白标记是一便捷,有效的体外标记、示踪方法,适于移植细胞的短期内示踪、观察.
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肿瘤坏死因子α诱导大鼠软骨细胞凋亡模型的建立及鉴定
背景：肿瘤坏死因子α是诱导骨关节炎软骨细胞凋亡的主要细胞因子，对骨关节炎的病理进程具有重要调节作用。
目的：比较不同质量浓度肿瘤坏死因子α诱导大鼠软骨细胞凋亡模型，为进一步探讨药物对软骨细胞凋亡的调控作用提供理论支持。
方法：清洁级4周龄SD大鼠，采用机械-Ⅱ型胶原酶消化法获取膝关节软骨细胞，并用不同质量浓度的肿瘤坏死因子α(0，10，20，30，40μg/L)诱导建立软骨细胞的凋亡模型，倒置相差显微镜观察软骨细胞的形态结构，Ⅱ型胶原免疫组化鉴定软骨细胞，MTT检测软骨细胞的活性，DAPI检测软骨细胞的凋亡情况。
结果与结论：①体外培养软骨细胞，Ⅱ型胶原免疫组化染色可见胞浆呈棕黄色，为阳性细胞；②软骨细胞凋亡率，干预48 h肿瘤坏死因子α10，20，30μg/L明显高于0μg/L(P<0.01)，肿瘤坏死因子α40μg/L明显高于10μg/L(P<0.01)；③软骨细胞活性，干预48 h肿瘤坏死因子α10，20，40μg/L明显低于0μg/L(P<0.01)，肿瘤坏死因子α20μg/L明显低于10μg/L(P<0.05)，肿瘤坏死因子α40μg/L明显低于10μg/L(P<0.01)、20μg/L(P<0.05)。④结果说明，20μg/L肿瘤坏死因子α能成功建立炎症介导软骨细胞凋亡模型。 -
SPIO、DAPI双重标记猕猴骨髓间充质干细胞：对细胞活性及增殖的影响
背景：传统的细胞移植示踪方法均需要在体外状态下进行组织学切片鉴定和分析，这显然限制了干细胞移植进入临床应用，因此，探索无创的、可多次重复应用的活体示踪方法已成为迫切亟待解决的问题。
目的：观察SPIO和DAPI双标记猕猴骨髓间充质干细胞的效果及对干细胞存活、增殖的影响。
方法：全骨髓贴壁法分离培养猕猴骨髓间充质干细胞，并采用流式细胞术对骨髓间充质干细胞进行鉴定。用SPIO和DAPI双标记骨髓间充质干细胞，通过荧光显微镜观察DAPI标记阳性率，普鲁士蓝染色和透射电镜鉴定SPIO标记阳性率，MTT检测标记细胞的活性、增殖能力。
结果与结论：采用全骨髓贴壁法成功获得高纯度猕猴骨髓间充质干细胞，纯度达95.1%。SPIO和DAPI成功标记骨髓间充质干细胞，标记阳性率达95%-98%，且对干细胞的活性、增殖无影响。 -
甲状腺非典型腺瘤中DAPI核染色、Ki-67表达及意义
目的 探讨4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)细胞核染色、Ki-67在甲状腺非典型腺瘤(atypical thyroid adenoma,ATA)中的表达及临床意义.方法 采用免疫组化EnVision两步法和免疫荧光染色法分别检测ATA、甲状腺滤泡癌(follicular thyroid carcinoma,FC)中Ki-67增殖指数及DAPI核染色情况.结果 DAPI在低、高核级ATA组织中的阳性率分别为12.50％ (2/16)、16.13％(5/31),两组相比差异无统计学意义(x2=0.01,P＞0.05);其在对照组FC中的阳性率为85.71％(6/7),两组相比差异有统计学意义(x2=13.17,P＜0.01);Ki-67在低、高核级ATA组织中的阳性率分别为6.25％(1/16)、6.45％(2/31),二者相比差异无统计学意义(x2 =0.36,P＞0.05);而在对照组FC中的阳性率为85.71％ (6/7),二者相比差异有统计学意义(x2=22.19,P＜0.01);Ki-67、DAPI表达与ATA患者年龄、结节数量、肿块大小无关.结论 联合检测Ki-67和DAPI可能对ATA与FC的鉴别诊断有一定价值.Ki-67、DAPI与ATA核级别、患者年龄、肿块大小和结节数量无关.
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DAPI联合PKH26标记骨髓干细胞在急性肝脏损伤模型小鼠肝内迁移的示踪作用
目的 探讨PKH26和DAPI联合标记骨髓干细胞在肝脏组织内迁移过程中的示踪作用.方法 用PKH26和DAPI联合标记从Balb/c小鼠骨髓中分离出骨髓干细胞,用CCl4腹腔注射的方法制备小鼠急性肝脏损伤模型后,将标记的BMMC经尾静脉移植入急性肝脏损伤模型小鼠体内,对照组经尾静脉注入磷酸盐缓冲液(PBS).移植2周后取肝脏组织,通过激光共聚焦荧光显微镜观察骨髓干细胞向肝脏内迁移的情况.结果 接受骨髓干细胞移植组小鼠肝脏组织内可发现DAPI和PKH26双重标记的骨髓干细胞.结论 PKH26 和DAPI可以联合标记向急性肝损伤模型肝组织迁移的骨髓干细胞,为体内示踪骨髓干细胞脑内迁移提供更加准确的实验方法.
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骨髓间质干细胞移植对实验性肺纤维化的治疗作用
目的:研究骨髓间质干细胞(BMSCs)对博来霉素A5(BLMA5)所致大鼠肺纤维化的治疗作用,并探讨其治疗机制.方法:雌性SD大鼠70只随机分为A组21只为生理盐水对照组;B组21只为BLMA5模型组;C组21只为气管内注入BLMA5后立即移植BMSCs;D组7只为气管内注入BLMA514 d后移植BMSCs.C、D组分别于BLMA5造模后立即、14 d后通过尾静脉注入4,6-联脒-2-苯基吲哚(DAPI)标记的BMSCs.A、B、C组大鼠分别于第7、14、28天、D组第28天时各处死大鼠7只行HE及Masson染色;荧光显微镜下检测标记细胞、肺组织内羟脯氨酸(HYP)含量,分析肺内胶原沉积情况;免疫组化观察MMP-2、TGF-β1表达.结果:①C组第7、14、28天及D组第28天肺组织均见到标记的BMSCs.②HE及Masson染色切片,与A组比较B组第7天肺泡炎明显,第28天肺纤维化重(P<0.01);C、D组均轻于B组,C组轻于D组(均P<0.05).③B组注BLMA5第7天,HYP含量及TGF-β1表达均开始升高,第28天高,各组间比较均有变化(P<0.05).④B组MMP-2的表达在第7天时多,与A、C组比较有明显差异(P<0.01),第28天时下降到较低水平,各组比较无差异.结论:骨髓间质干细胞可定植于受损的肺组织,并能有效阻止BLMA5诱导的早期大鼠肺纤维化形成,其机制可能与降低TGF-β1、MMP-2的表达有关,早期治疗效果优于晚期.
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骨髓基质干细胞豚鼠内耳移植初步观察
目的建立骨髓基质干细胞(marrow stromal cell,MSC)内耳移植技术,研究内耳细胞移植的可行性.方法将豚鼠骨髓基质干细胞分离培养,用4,6-联脒-2-苯基吲哚(4,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)荧光标记,采用显微注射技术在耳蜗底周鼓阶钻孔,通过钻孔处缓缓注入细胞,术后14天处死,行耳蜗石腊切片,荧光显微镜及HE染色观察移植细胞成活情况.结果骨髓基质干细胞内耳移植成活,并贴壁生长.结论成功地建立了骨髓基质干细胞内耳移植技术,为进一步研究MSC在内耳的分化和表达奠定了重要的基础.
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Hoechst 33342与DAPI标记细胞核对胞内活性氧检测效果的比较
目的 探讨Hoechst 33342与DAPI两种荧光染料标记细胞核后对细胞内活性氧水平的影响.方法 静息培养的血管平滑肌细胞加入晚期糖基化终末产物作用10 min,加入标记活性氧的荧光探针H2DCFDA,再分别加入Hoechst 33342和DAPI不同荧光染料进行核标记.荧光显微镜下观察细胞核被标记的数目与细胞内活性氧的荧光水平.结果 Hoechst 33342染料标记5 min后即可见细胞核被标记上,随着时间的延长被标记的核数目并不发生改变;而与之明显不同的是,DAPI染料标记5 min时,只有几个细胞核被标记上,但随着时间的延长被标记的核数目越来越多.Hoechst 33342标记后细胞内活性氧的荧光强度并不随时间的延长发生变化,而DAPI标记后细胞内活性氧绿色荧光的细胞数就越少,DAPI标记的细胞核数与显示活性氧绿色荧光的细胞数呈反比.这些结果提示,DAPI染料在标记细胞核时破坏了活性氧在细胞内的储存,干扰了实验结果.结论 检测细胞内活性氧时,应使用Hoechst 33342核标记染料而不能用DAPI.
关键词： 活性氧 血管平滑肌细胞 Hoechst 33342 DAPI -
miR-449a与胃癌的相关性
目的:从临床及细胞学角度探究miR-449a与胃癌发生的相关性.方法:应用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测胃癌组织与癌旁周围正常组织中miR-449a表达水平;使用Lipofectamine 2000转染法对MGC803细胞系miR-449a表达进行上调及下调,采用实时细胞动态监测(RTCA)系统及DAPI染色法检测MGC803细胞生长与凋亡情况.结果:(1)相比癌旁周围正常组织,胃癌组织中miR-449a为低表达,其相对表达量为(23.934±4.566,P=0.000);(2)相对于对照组,上调MGC803细胞系miR-449a表达后,RTCA实验结果细胞增殖速度降低(3.947±3.677,P=0.000),DAPI染色结果显示细胞凋亡增加(59.900±8.700,P=0.002);下调miR-449a表达后细胞增殖速度增快(9.005±1.372),凋亡减少(12.500±3.600).结论:miR-449a具有类似抑癌作用,其低表达与胃癌的发生、发展具有相关性.
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胎儿骨髓间充质干细胞生物学特征及荧光标记
目的:探讨分离、培养、扩增和荧光标记胎儿骨髓间充质干细胞(Bore mesenchymal stem cell,BMSCs)的方法及其生物学特征.方法:取4～5个月胎儿四肢骨骨髓,Ficoll离心、贴壁筛选法分离BMSCs,体外扩增,传至第12代.检测BMSCs的生长曲线,细胞周期和细胞表型,酶活性及糖原含量,以及DAPI标记BMSCs的标记率.结果:(1)BMSCs主要呈长梭形,漩涡状排列.传代细胞生长快于原代细胞,12代后的细胞出现衰老征象;(2)流式细胞术检测第3、8代细胞表达CD29、CD71,不表达CD34、HLA-DR;C0和G1期细胞约为93.73%,S、M和G2期为6.27%;(3)第5代细胞的非特异性酯酶及糖原均为阳性,碱性磷酸酶为弱阳性;(4)DAPI标记后的BMSCs生长正常,标记率为100%,后逐渐减弱,3周时标记率仅15%.结论:分离获得的胎儿BMSCs具有MSCs的特征.DAPI标记是短期示踪BMSCs的有效方法.
